異氟烷預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注時(shí)腦線粒體鈣及線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)通道的影響

沈 潔，從長慧

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽 110004）

異氟烷預(yù)處理對大鼠肝缺血再灌注時(shí)腦線粒體鈣及線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)通道的影響

沈 潔，從長慧

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽 110004）

目的 通過觀察在體大鼠肝部分缺血再灌注損傷后腦線粒體游離鈣、線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)通道（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）及外周血中S-100β蛋白含量的變化，明確異氟烷預(yù)處理對大鼠肝部分缺血再灌注時(shí)腦損傷是否具有保護(hù)作用及可能的機(jī)制。方法 SD大鼠75只隨機(jī)分成假手術(shù)組（S組）；缺血再灌注組（I/R組）：肝缺血60 min，再灌注120 min；異氟烷預(yù)處理組（ISO組）：肝I/R前60 min ISO預(yù)處理30 min，后用空氣洗脫30 min：CsA+ISO組，CsA50 mg/kg靜脈內(nèi)注射，30 min后同ISO組；CsA組，I/R前30 min CsA50 mg/kg靜脈內(nèi)注射。再灌注24 h迅速斷頭取前腦，分離線粒體進(jìn)行線粒體游離鈣、MPTP含量檢測，各組分別于缺血前及再灌注120 min后抽取靜脈血采用雙抗體夾心-ELAISA法測定S-100β蛋白含量。結(jié)果 I/R組（287.32± 26.17）線粒體游離Ca2+濃度明顯增加，高于S組（198.54±21.02）和ISO組（209.74±29.49）（P＜0.05）；CsA+ ISO（267.31±37.52）明顯高于ISO組（P＜0.05）；CsA（288.63±23.15）組與I/R組間比較差異無顯著意義（P＜0.05）；I/R組（1.73±0.24）的ΔS與S組（2.36±0.35）和ISO組（2.11±0.32）相比明顯減少（P ＜0.05），既MPTP大量開放，而后兩組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；I/R組與CsA+ISO組（1.72±0.34）和CsA組（1.77 ±0.35）△S之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CsA+ISO組的ΔS值與ISO組相比明顯降低（P＜0.05）。外周血液S-100β蛋白I/R組明顯高于S組和ISO組（P＜0.05）；CsA+ISO組與ISO組比較顯著升高（P＜0.05），I/R組，CsA+ISO組和CsA組與缺血前比較明顯升高（P＜0.05），缺血前S-100β蛋白含量五組無顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論 大鼠肝部分缺血再灌注后對腦組織造成了一定程度損傷，而異氟烷預(yù)處理對此損傷具有一定保護(hù)作用；其作用的機(jī)制可能與異氟烷抑制MPTP開放，降低線粒體游離Ca2+濃度，防止了線粒體Ca2+超載有關(guān)。

異氟烷；肝缺血再灌注；腦；大鼠；線粒體鈣；線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)通道

腦保護(hù)是圍術(shù)期醫(yī)學(xué)的重要內(nèi)容，特別是經(jīng)歷手術(shù)創(chuàng)傷及全麻后大腦功能會受到怎樣的影響越來越受到人們的關(guān)注，這就要求我們圍術(shù)期醫(yī)生特別是麻醉醫(yī)生不僅要保證患者生命安全還要最大程度保證手術(shù)麻醉后病人腦功能不受影響。雖然圍術(shù)期腦保護(hù)措施有很多種，但通過應(yīng)用藥物使腦組織對損傷不易感的預(yù)處理、后處理及同時(shí)處理干預(yù)是目前已知的圍術(shù)期治療的重要干預(yù)措施之一［1-3］。筆者前期研究表明吸入麻醉藥異氟烷（isoflurane，ISO）預(yù)處理對鼠腦及肝直接的缺血再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）損傷具有保護(hù)作用，且發(fā)現(xiàn)這種作用與抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)通道（mitochondrial permeability transition pore，MPTP），降低線粒體Ca2+超載有關(guān)［4］。但臨床工作中往往存在某一臟器的直接損傷可能會引起其遠(yuǎn)隔臟器的損傷。有研究表明血漿和腦脊液中S-100β蛋白含量的變化與神經(jīng)系統(tǒng)的疾病和損傷有關(guān)，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞損傷時(shí)S-100β蛋白從胞液中滲出進(jìn)入腦脊液和（或）經(jīng)受損的血腦屏障進(jìn)入血液中，因此S-100β蛋白在血漿中的濃度變化可以反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害程度，并已成為判斷和評估腦損傷預(yù)后的特異性指標(biāo)［5］。目前，麻醉藥物對肝臟手術(shù)后遠(yuǎn)隔器官的保護(hù)方面的研究還很少［6-7］。本研究通過觀察在體大鼠肝部分缺血再灌注損傷后腦組織線粒體游離鈣、MPTP含量檢測及外周血中S-100β蛋白含量的變化，探討大鼠肝部分缺血再灌注后對腦組織是否造成了損傷、異氟烷預(yù)處理對其是否具有保護(hù)作用，通過應(yīng)用環(huán)孢菌素A（MPTP特異性阻滯藥，cycloporin A，CsA）后觀察上述指標(biāo)的變化進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物選擇及分組

健康雄性清潔級SD大鼠75只，體重在280～350 g（北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK （京）2009-0004】，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用合格證號：【SYXK （遼）2010-0008】，分5組每組15只。假手術(shù)組（S組），缺血再灌注組（I/R組），異氟烷預(yù)處理組（ISO組），CsA+ISO組和CsA組

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝缺血再灌注模型的制作建立大鼠肝缺血再灌注模型［8］，10％水合氯醛（0.35 g/kg）腹腔注射麻醉后固定于實(shí)驗(yàn)臺上，氣管切開，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，左頸內(nèi)靜脈穿刺，持續(xù)輸注乳酸鈉林格氏液7 mL/kg·h，水合氯醛持續(xù)泵入，維持麻醉狀態(tài)，采用腹部弧形切口，充分顯露第一肝門部，入腹后分離肝十二指腸韌帶，分離膽總管，應(yīng)用無創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷肝左葉及中葉血流，造成70％肝臟缺血，但不阻斷右葉肝血流，60 min后松開動(dòng)脈夾，再灌注120 min。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程利用燈泡加熱，使直腸溫保持在36.7℃ ～37.3℃。

1.2.2 異氟烷預(yù)處理 將鼠吸入異氟烷，使異氟烷的 肺 泡 最 低 有 效 濃 度 （minimal alveolar concentration，MAC）維持在1.0 MAC，（Datex氣體監(jiān)測儀監(jiān)測）。

1.2.3 分組

S組：入腹后只分離肝十二指腸韌帶，但不阻斷肝門血供；

I/R組：肝缺血60 min，再灌注120 min；

ISO組：肝I/R前60 min ISO（雅培公司）預(yù)處理30 min，后用空氣洗脫30 min；

CsA+ISO組：CsA（sigma公司）50 mg/kg靜脈內(nèi)注射，30 min后同ISO組；

CsA組：I/R前30 min CsA 50 mg/kg靜脈內(nèi)注射。

1.2.4 取材及檢測

再灌注24 h迅速斷頭取前腦，置于冰塊上并用冰生理鹽水沖洗，采用低溫（0℃ ～4℃）差異離心法分離前腦線粒體，用分離介質(zhì)（0.25 mol/L蔗糖、0.0001 mol/L EDTA-2Na、0.005 mol/L的Tris-HCl、0.8％NaCl，pH=7.4）制備線粒體懸浮液。取出少許懸浮液，用中性紅-詹納斯綠B染色后，在高倍顯微鏡下觀察，被染成亮綠色顆粒即線粒體。

MPTP開放程度的測定 用1601型紫外分光光度計(jì)（島津公司，日本）在540 nm波長處記錄每分鐘吸光度的變化，平衡后的吸光度變化值（△S）反映 MPTP開放的程度，△S越小，代表MPTP開放的程度越大，線粒體蛋白濃度為0.5 mg/m L。

線粒體游離Ca2+濃度的測定 根據(jù)文獻(xiàn)［9］介紹的方法略加改進(jìn)。以Fura-2/AM（Sigma公司，美國）為Ca2+熒光指示劑，用850型熒光分光光度計(jì)（Hitachi公司，日本）測定線粒體游離Ca2+濃度，發(fā)射波長510 nm，以430 nm激發(fā)光譜掃描。根據(jù)實(shí)測熒光值（F）、最大（Fmax）及最小（Fmin）熒光強(qiáng)度比值計(jì)算出 Ca2+濃度，［Ca2+］i =Kd{（F-Fmin）/（Fmax-F）}，Kd為熒光指示劑的介電常數(shù)，F(xiàn)ura-2=224 nmol/L，（單位為nmol/mg·L）。

各組分別于缺血前及再灌注120 min后抽取靜脈血2 mL，靜置15 min后，3000 r/min離心20 min，取血清-80℃冰箱保存，測定S-100β蛋白含量，采用雙抗體夾心-ELAISA法檢測（購自大連生物科技有限公司），按說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有計(jì)量數(shù)據(jù)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以（ˉ±s）表示，組間差異比較采用單因素方差（One-Way ANOVE）分析，LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體Ca2+濃度的變化

I/R組Ca2+濃度（287.32±26.17）明顯高于S組（198.54±21.02）和ISO組（209.74±29.49）（P＜0.05）；ISO組Ca2+濃度高于S組，但差異無顯著意義（P ＞ 0.05）；而 CsA+ISO組 Ca2+濃度（267.31±37.52）明顯高于 ISO組（P ＜0.05）；CsA組（288.63±23.15）與I/R組間差異無顯著意義（表1）。

2.2 MPTP開放程度（△S）的變化

與I/R組（1.73±0.24）相比，S組（2.36± 0.35）和ISO組（2.11±0.32）的△S明顯增加（P＜0.05），而后兩組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；I/R組與 CsA+ISO組（1.72±0.34）和 CsA組（1.77±0.35）△S之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；CsA+ISO組的△S值與ISO組相比明顯降低（P＜0.05）（表1）。

2.3 外周血中S-100β蛋白含量的變化

再灌注后，I/R組S-100β蛋白含量顯著高于S組（P＜0.05）；ISO組與I/R組相比S-100β含量明顯下降（P＜0.05），CsA+ISO組和CsA組與S組比較顯著升高（P＜0.05），與ISO組比較也升高顯著（P＜0.05），I/R組，CsA+ISO組和CsA組與缺血前比較明顯升高（P ＜0.05），缺血前S-100β蛋白含量五組無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 S-100β蛋白含量的變化Tab.2 The contents of S-100βprotein in serum

3 討論

臨床工作中往往存在某一臟器的直接損傷也可引起其遠(yuǎn)隔臟器（如腦組織）的損傷，這些均與腦灌注減少腦供血供氧失衡有關(guān)，血腦屏障及血管壁的破壞使腦缺血加重，自由基的急劇增加、腦微循環(huán)的病生理改變是再損傷的基礎(chǔ)［10-11］。肝缺血再灌注損傷不僅可以造成肝臟局部的損害，同時(shí)激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)釋放大量的細(xì)胞因子、蛋白水解酶，氧自由基和氧化氮等進(jìn)入血液循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)隔器官如心、腦、腎等，損害這些臟器。S-100蛋白是一種高度酸性的鈣結(jié)合蛋白，根據(jù)其亞單位結(jié)構(gòu)可分為S-100αα（S-100αo）、S-100αβ（S-100α）、S-100ββ （S-100β）三種。在生理情況下，其中S-100ββ蛋白特異地存在于中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，星形細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞及大膠質(zhì)細(xì)胞中。因此，S-100β蛋白被認(rèn)為是神經(jīng)膠質(zhì)的標(biāo)記蛋白，是腦特異蛋白［12］。缺血性疾病急性期血清和腦脊液中的S-100β蛋白升高顯著，主要原因是由于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞壞死后S-100β蛋白的釋放和血腦屏障受損后通透性的增高，S-100β蛋白在腦脊液和外周血中的濃度反映中樞神經(jīng)受損害的程度，故作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生化標(biāo)記物［13-14］。本實(shí)驗(yàn)中I/R組缺血再灌注120 min后外周血液S-100β蛋白顯著高于對照組，說明大鼠肝的損害造成了鼠腦細(xì)胞的損傷和血腦屏障的破壞。ISO組雖然與缺血前比較S-100β蛋白有一定升高，但與I/R組比較顯著下降，表明異氟烷預(yù)處理對鼠腦起到了一定保護(hù)作用，而CsA+ ISO組和CsA組外周血液S-100β蛋白的增加與I/R組基本一樣，說明異氟烷預(yù)處理對鼠腦的保護(hù)作用一定程度上受到的抑制與CsA有關(guān)，而單純應(yīng)用CsA后外周血液S-100β蛋白并未有變化。

肝臟I/R損傷的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其中鈣離子超載和MPTP開放是一個(gè)重要的原因［15-16］。正常情況下，神經(jīng)元膜內(nèi)外存在著極大的鈣離子電化學(xué)梯度，細(xì)胞的調(diào)控作用是細(xì)胞質(zhì)Ca2+維持在0.1～1.01 umol/L，而細(xì)胞外Ca2+則高達(dá)上萬倍約1.5 mmol/L，腦損傷后腦缺血再灌注可導(dǎo)致腦內(nèi)高能磷酸物質(zhì)快速消耗，不足以維持細(xì)胞內(nèi)外的正常離子梯度。從而使電壓依賴調(diào)控的鈣通道開放，造成嚴(yán)重的鈣穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞內(nèi)鈣超載，當(dāng)超過線粒體緩沖濃度范圍時(shí)，產(chǎn)生線粒體鈣超載，Ca2+增加可激發(fā)胞質(zhì)和胞核的一系列反應(yīng)造成組織損傷。線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)通道是一種由線粒體內(nèi)膜和外膜跨膜蛋白共同構(gòu)成的高電導(dǎo)非選擇性通道。其分子組成尚不完全清楚，許多證據(jù)表明它可能是由腺苷酸轉(zhuǎn)移酶（translocase of adenine nucleotides，ANT）、電壓依賴性陰離子通道（voltage dependent anion channel，VDAC）和親環(huán)素D（cyclophilin D，CyP-D）組成的［17-18］。正常情況下MPTP復(fù)合體僅允許相對分子量小于1.5×103的化合物通過，因此，它有維持線粒體基質(zhì)和胞質(zhì)之間滲透壓梯度的作用，致使高分子量化合物在線粒體基質(zhì)內(nèi)的濃度高于在線粒體膜間隙和胞質(zhì)的濃度。許多因素如Ca2+、自由基或膜電位降低都可觸發(fā)MPTP開放，選擇性釋放細(xì)胞色素 C及凋亡誘導(dǎo)因子（apotosis inducing factor，AIF）等物質(zhì)，提示MPTP開放可能是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。我們利用MPTP增大時(shí)線粒體膜內(nèi)外滲透失衡，導(dǎo)致吸光度明顯減少的原理，檢測了各組MPTP開放程度，發(fā)現(xiàn)肝I/R損傷后腦線粒體MPTP大量開放，同時(shí)腦組織線粒體游離Ca2+濃度明顯增加，這可能是線粒體自身調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)的不良后果，而Ca2+濃度增加又可誘發(fā)MPTP開放，產(chǎn)生正反饋的惡性循環(huán)，這與Kobayashi的研究［19］結(jié)果一致；表明肝缺血60 min，再灌注120 min后對腦產(chǎn)生了明顯的損傷；而大鼠吸入麻醉藥ISO進(jìn)行預(yù)處理后再進(jìn)行肝I/R線粒體游離Ca2+濃度明顯降低，異氟烷預(yù)處理防止了線粒體Ca2+超載，起到了一定腦保護(hù)作用；另外，發(fā)現(xiàn)進(jìn)行ISO預(yù)處理后鼠腦的MPTP的開放受到明顯抑制，MPTP受到抑制后使線粒體游離Ca2+濃度降低，而Ca2+濃度降低又可抑制MPTP的開放，因此減輕了I/R對鼠腦的損傷，表明ISO預(yù)處理作用可能是通過抑制MPTP開放介導(dǎo)的。而Ca2+又是MPTP開放的主要誘發(fā)因子，過量的Ca2+超過線粒體自身的承受限度時(shí)，則促使MPTP開放，使線粒體基質(zhì)代謝物喪失，膜電勢消失，ATP耗竭，線粒體腫脹，造成細(xì)胞損傷［17］。Kobayashi等人［19］的研究顯示應(yīng)用環(huán)孢菌素A后可以減輕海馬CA1的遲發(fā)性細(xì)胞損傷，證明MPTP與遲發(fā)性神經(jīng)損傷有關(guān)，并且是I/R所致腦細(xì)胞損傷的關(guān)鍵部位。所以，減少線粒體 Ca2+超載，抑制MPTP的開放，維持線粒體形態(tài)及功能正常，某種程度上可能防止腦神經(jīng)細(xì)胞死亡，起到腦保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中我們也設(shè)立了CsA組（藥物空白對照），其線粒體游離Ca2+濃度和MPTP結(jié)果與I/R組比較均沒有顯著性差異，說明特異性MPTP阻滯劑CsA本身對大鼠腦損傷沒有明顯作用；同時(shí)我們又對鼠進(jìn)行ISO預(yù)處理前采用CsA靜脈注射干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)線粒體游離Ca2+濃度明顯增加，MPTP大量開放，逆轉(zhuǎn)了ISO預(yù)處理使線粒體游離Ca2+濃度降低及抑制MPTP開放作用，取消了ISO預(yù)處理的腦保護(hù)作用，進(jìn)一步證明ISO預(yù)處理作用機(jī)制可能是與抑制MPTP開放有關(guān)。

CsA是臨床應(yīng)用的一種免疫抑制劑，且有一定肝毒性。有研究發(fā)現(xiàn)CsA對細(xì)胞凋亡有一定調(diào)節(jié)作用，既有抑制細(xì)胞凋亡作用也有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用［20］。CsA與 CyclophilinD組成復(fù)合體來抑制MPTP的開放，而我們前期研究發(fā)現(xiàn)異氟烷腦保護(hù)作用與抑制MPTP的開放有關(guān)，那么異氟烷與CsA是否有相同作用部位，從而取消了異氟烷腦保護(hù)作用，這有待于進(jìn)一步研究。我們設(shè)立了CsA組，從線粒體鈣水平的檢測看并未有明確的細(xì)胞損傷，也沒有顯示有細(xì)胞保護(hù)作用，這可能與動(dòng)物模型或使用劑量有關(guān)。此研究我們沒有進(jìn)行相關(guān)凋亡因子的檢測，另外肝缺血再灌注損傷所造成的腦組織一定程度損傷的具體機(jī)制及可能的信號傳導(dǎo)也沒有進(jìn)行研究，這有待于今后進(jìn)一步研究探討。

本研究通過觀察在體大鼠肝部分缺血再灌注損傷后外周血S-100β蛋白含量的變化，結(jié)合腦組織線粒體游離鈣和線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)通道的變化，明確大鼠肝部分缺血再灌注后對鼠腦造成了損傷，而異氟烷預(yù)處理對此損傷具有一定保護(hù)作用；并且通過應(yīng)用特異性MPTP阻滯劑CsA干擾后，進(jìn)一步探討了其作用的機(jī)制可能與抑制MPTP開放，降低線粒體游離Ca2+濃度，防止了線粒體Ca2+超載有關(guān)。

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Preconditioning effect of isoflurane on m itochondria free calcium concentrate and m itochondria permeability transition pore after liver ischem ia-reperfusion injury in rat brain

SHEN Jie，CONG Chang-hui
（Department of Anesthesiology，Shengjing Hospital of China Medical University，Shenyang 110004，China）

Objective To investigate the protective effect and themechanism of isoflurane preconditioning on rat brain tissue suffering from rat liver ischemia-reperfusion injury.Methods 75 SD rats were randomly divided into five groups，sham group（S group）；ischemia-reperfusion group（I/R group）：liver ischemia for 60 min，reperfusion for 120min；isoflurane preconditioning group（ISO group）：60 min before liver I/R，ISO pretreatment for 30 min；CsA+ISO group；CsA（MPTP specific blocker）50 mg/kg intravenous injection，the same as ISO group after 30 min；CsA group：CsA 50 mg/kg intravenous injection.30 min before I/R.The animals were killed 24 h after ischemia and their brain were excised formeasurement ofmitochondrial permeability transition pore（MPTP）and calcium content in mitochondria.The measurement of content of S-100βprotein in serum before ischemia and 120min after reperfusion through the application of Elisa kit.Results Themitochondrial Ca2+concentration of I/R group（287.32±26.17）was higher than that in S group （198.54±21.02）and the ISO group（209.74±29.49）（P ＜0.05），and Ca2+concentration of CsA+ISO group （267.31±37.52）was higher than the ISO group（P＜0.05）；therewas not statistical significance between I/R and CsA group（288.63±23.15）（P ＜0.05）.MPTP were more opened in I/R group（△S：1.73±0.24）than that in S group （△S：2.36±0.35）and ISO group（△S：2.11±0.32）（P＜0.05），butMPTPweremore opened in CsA+ISO group than that in ISO group（P ＜0.05）.The content of S-100βprotein in serum was significantly higher in I/R group than that in sham and ISO groups（P＜0.05），and the contentof S-100βprotein in serum was significantly higher in CsA+ISO group than in the ISO groups（P ＜0.05）.Conclusion The liver ischemia-reperfusion may injury the brain of the rat and isoflurane preconditioning can protect the brain on the rat.The reduce ofmitochondria calcium overload and inhibition of MPTP opening are involved in themechanism.

Isoflurane；Liver ischemia-reperfusion； Brain； Rat； Mitochondria calcium；Mitochondrial permeability transition pore

R971.2 R332

A

1671-7856（2014）03-0025-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2014.003.006

遼寧省教育廳課題項(xiàng)目（2008792）。

沈潔（1963-），碩士生導(dǎo)師，博士，副教授。研究方向：麻醉藥物與器官保護(hù)。E-mail：Shenjie-63@163.com。

2014-02-11

研究報(bào)告