響應(yīng)面法優(yōu)化芝麻餅粕蛋白的制備條件1

王振斌，王璽，林曉明，馬海樂，王林，馬曉珂，王干，白志杰

( 江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

芝麻屬胡麻科（Pedecliecease）胡麻屬（Sesamum indicum L.）植物，又名胡麻、白麻、油麻、脂麻，是世界上最古老的油料作物之一，產(chǎn)量在世界油料作物中占第七位[1-4]。芝麻餅粕是芝麻籽實(shí)取油后的副產(chǎn)物。在我國 80%以上的芝麻用來榨取芝麻油，年產(chǎn)量就在 50萬 t以上。芝麻餅粕蛋白質(zhì)平均含量在40%～46%，粗脂肪含量在3.4%～10.3%，粗纖維含量在2.6%～5.6%，還含有少量的鈣、磷等礦物質(zhì)[4]。芝麻餅粕蛋白質(zhì)氨基酸種類齊全，并且含量豐富，特別是含硫氨基酸（蛋氨酸、半胱氨酸和色氨酸），顯著高于其他植物，且無抗?fàn)I養(yǎng)因子[5]，除賴氨酸含量略低外，其他接近或達(dá)到FAO/WHO的推薦值，是一種很好的蛋白質(zhì)資源[6-7]。

分離制備植物蛋白質(zhì)的方法多種多樣，例如堿溶酸沉法、酶解法、反膠束法、膜分離法等[8-18]。堿溶酸沉法是目前應(yīng)用的最多而且已用于產(chǎn)業(yè)化的方法，該法操作簡(jiǎn)便、易于控制、成本低廉。芝麻蛋白質(zhì)主要是堿溶性蛋白質(zhì)，約占67%，在堿性條件下溶解度較大，一般仍采用堿溶酸沉法從芝麻餅粕制取芝麻分離蛋白質(zhì)[7-8]。目前研究大多以測(cè)定溶解在堿液中的氮的總量計(jì)算提取率，而蛋白質(zhì)在堿液中降解為肽或氨基酸的部分難以酸沉得到，導(dǎo)致蛋白提取率難以準(zhǔn)確判斷。以水代法制備芝麻油的餅粕制備蛋白的研究較少。

本文以芝麻餅粕為原料，采用堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)，并通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化出堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)的最佳工藝參數(shù)，為芝麻餅粕蛋白質(zhì)進(jìn)一步制備功能肽等的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芝麻餅粕 新沂吉順昌油脂科技有限公司，其中粗蛋白質(zhì)35.99%，粗脂肪15.28%，水分8.48%，灰分9.96%，其他35.61%。

無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、硫酸、硫酸銅、硫酸鉀等（分析純） 購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

Fz-4藥物粉碎機(jī) 溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠；pH5-3C型pH計(jì) 上海理達(dá)儀器廠；HH-A恒溫水浴攪拌鍋 江蘇金壇市中大儀器廠；SPF401F電子天平 奧豪斯國際貿(mào)易（上海）中國有限公司；TGL-16高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限公司；FOSS 2100型凱氏定氮裝置 上海新嘉電子有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)的工藝 取過 80目篩的芝麻餅粕若干克，加入90mL的去離子水配成相應(yīng)濃度的溶液，以1mol/L NaOH溶液調(diào)pH，在一定溫度下用磁力攪拌器攪拌一定時(shí)間。離心過濾，所得上清液即為芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取液。以1mol/L 鹽酸調(diào)上清液pH至4.0（芝麻餅粕蛋白質(zhì)等電點(diǎn)）使蛋白質(zhì)沉淀，靜止30min后4500r/min離心20min，棄上清，所得沉淀再加5倍體積70%乙醇，室溫浸泡30min，離心，再加兩次2倍體積去離子水洗滌，離心，下層蛋白質(zhì)真空冷凍干燥即得芝麻餅粕蛋白質(zhì)產(chǎn)品。測(cè)定其蛋白質(zhì)含量，并計(jì)算蛋白質(zhì)提取率。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取率和蛋白質(zhì)得率的計(jì)算 采用半微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，用式（1）和式（2）計(jì)算芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率和得率：

1.2.3 堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)的單因素設(shè)計(jì) 在堿液提取芝麻餅粕蛋白質(zhì)的過程中，分別研究NaOH濃度（0、0.11、0.22、0.33、0.44、0.55mol/L），液料比（5、10、15、20、25、30、35mL/g），提取溫度（30、40、50、60、70、80、90℃），提取時(shí)間（0.5、1、2、3、4、5、6h）及提取次數(shù)（1、2、3、4次）對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.2.4 堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì) 根據(jù)Box-Behnken[19-20]中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取NaOH濃度、提取溫度、提取時(shí)間、液料比為響應(yīng)面分析試驗(yàn)的因素，進(jìn)行4因素3水平設(shè)計(jì)（表1）。通過Design Expert 7.0 Trial軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，預(yù)測(cè)最優(yōu)參數(shù)。

表1 響應(yīng)面分析因素與水平表Tab.1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.5 芝麻餅粕蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定 將提取的芝麻餅粕蛋白質(zhì)溶液，分裝到 5只離心管中，每只100mL，用HCl調(diào)至不同的pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0），靜止30min后4500r/min離心20min，測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量，并計(jì)算蛋白質(zhì)的沉淀量。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法 采用 SPSS軟件分析，所得試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示。p<0.05 為差異顯著水平，p<0.01 為差異極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)的單因素試驗(yàn)

2.1.1 NaOH濃度對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響 在液料比為15，提取溫度為60℃，提取時(shí)間為4h，提取次數(shù)1次的條件下，NaOH濃度對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響如圖1（A）所示。由圖1（A）可知，在NaOH濃度0～0.33 mol/L范圍內(nèi)，芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率隨 NaOH濃度的增大而提高，各組間差異顯著（p<0.05）。當(dāng)NaOH濃度為0.33 mol/L時(shí)蛋白質(zhì)提取率達(dá)到57.36%，此后隨著NaOH濃度的繼續(xù)升高蛋白質(zhì)提取率未見顯著變化。芝麻蛋白質(zhì)中，80%為α球蛋白質(zhì)，由于經(jīng)過壓榨處理而變性，其水溶性降低，但仍可在堿性條件下適度降解而溶出。稀堿有利于蛋白質(zhì)的提取，過高堿液濃度時(shí)，蛋白質(zhì)提取率有所下降，并且過高堿液濃度會(huì)改變蛋白質(zhì)的營養(yǎng)學(xué)特性，生成賴氨酰丙氨酸這些物質(zhì)有毒，引起營養(yǎng)物質(zhì)的損失[21]。高堿還會(huì)使蛋白質(zhì)變性和水解，不利于被酸沉淀，影響蛋白質(zhì)提取率，同時(shí)，也增強(qiáng)了美拉德反應(yīng)，影響產(chǎn)品色澤[22]。綜合考慮，選擇NaOH濃度0.33 mol/L作進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.2 液料比對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響 在提取液 NaOH濃度為 0.33 mol/L，提取溫度為60℃，提取時(shí)間為4 h，提取次數(shù)1次的條件下，液料比對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響如圖1（B）所示。由圖1（B）可知，隨著液料比的增大，芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率不斷增大，當(dāng)液料比為25時(shí)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率為 66.09%，此后隨著液料比繼續(xù)增大，蛋白質(zhì)提取率增加緩慢。如果液料比過小，提取體系的黏度過大，物料擴(kuò)散速度慢，不利于蛋白質(zhì)的溶出，使提取不完全。增大液料比，蛋白質(zhì)提取率增加，但增加的幅度不大，且過大的料液比不利于蛋白質(zhì)提取后的濃縮沉淀。因此考慮到成本及后面的離心沉淀步驟，選取液料比25作進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.3 提取溫度對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響 在提取液 NaOH濃度為 0.33 mol/L，液料比為25，提取時(shí)間為4 h，提取次數(shù)1次的條件下，提取溫度對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響如圖1（C）所示。由圖1（C）可知，在溫度30～60℃范圍內(nèi)，芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率隨溫度的升高而提高，各組間差異顯著（p<0.05）；當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)蛋白質(zhì)提取率為74.05%，此后再提高溫度，蛋白質(zhì)提取率增加緩慢。這是因?yàn)檩^高的溫度增加了蛋白質(zhì)的溶解度和溶出速率?？紤]到過高的溫度可能對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性造成影響，并且溫度高，能耗大，因此選取提取溫度70℃作進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響 在提取液 NaOH濃度為 0.33 mol/L，液料比為25，提取溫度為70℃，提取次數(shù)1次的條件下，提取時(shí)間對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響如圖 1（D）所示。由圖 1（D）可知，在提取時(shí)間0～4 h范圍內(nèi)，芝麻餅粕蛋白質(zhì)的提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，超過4 h后芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率稍有下降。這可能是由于在加熱作用下分子震動(dòng)加快，摩擦增加蛋白質(zhì)的溶解作用，從而有利于提取。但是提取時(shí)間過長(zhǎng)可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性?？紤]到能源和蛋白質(zhì)在高溫下品質(zhì)保持的問題，故選擇提取時(shí)間4 h作進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響 在提取液 NaOH濃度為 0.33 mol/L，液料比為25，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為4h的條件下，提取次數(shù)對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響如圖1（E）所示。由圖1（E）可知，提取次數(shù)對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響不顯著（p>0.05)。多次提取試驗(yàn)不僅耗能耗時(shí)，而且對(duì)蛋白質(zhì)提取的影響很小，因此選取提取次數(shù)1次作進(jìn)一步蛋白質(zhì)優(yōu)化的研究。

1 各因素對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響注：A ：NaOH濃度、B：液料比、C：提取溫度、D：提取時(shí)間和E：提取次數(shù)Fig.1 Effects of the extraction conditions on the extraction rate of sesame cake protein

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)的提取工藝

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率影響顯著的4個(gè)因素（NaOH濃度、提取溫度、提取時(shí)間、液料比），利用Design-Expert 7.0 Trial軟件設(shè)計(jì)了4因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab. 2 Design and result of Box-Behnken experiment

23 0 -1 0 1 68.56 24 0 1 0 1 75.13 25 0 0 0 0 74.9 26 0 0 0 0 73.28 27 0 0 0 0 72.97

表3 方差分析Tab. 3 Analysis of variance

各因素經(jīng)二次多項(xiàng)回歸擬合后，得到芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率（Y）與 NaOH濃度、提取溫度、液料比、提取時(shí)間四個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程如式（3）所示：

從表 4可以看出，該模型回歸極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，并且該模型的R2=0.9480，R2Adj=0.8874，說明回歸方程的擬合度較好，可以較好解釋模型的變化。其中模型一次項(xiàng)X1、X2、X3、X4，交互項(xiàng)X1X4、二次項(xiàng)X12對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響是極顯著的，X22達(dá)到顯著水平，其余項(xiàng)均不顯著。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對(duì)結(jié)果的影響排序，NaOH濃度>提取溫度>液料比>提取時(shí)間。

剔除不顯著項(xiàng)，簡(jiǎn)化后的二次多項(xiàng)回歸方程如式（4）所示：

根據(jù)回歸方程得到因子間的響應(yīng)面分析圖，如圖2所示。圖2反映了提取時(shí)間、NaOH濃度、液料比和提取溫度各因素兩兩之間的交互作用對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率的影響。

圖2 交互作用對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率影響的響應(yīng)圖Fig.2 Response surface of effects on extraction rate of sesame cake protein

通過響應(yīng)面回歸方程，經(jīng) Design-expert軟件分析，可以得出模型中最佳條件參數(shù)：NaOH濃度0.37 mol/L，提取溫度75.19℃，提取時(shí)間4.7 h，液料比25.19，提取次數(shù)1次，在此參數(shù)下芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率為76.22%。按上述最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)三次芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率分別為77.15%、76.84%、76.56%，其平均值為76.85%，與模型理論預(yù)測(cè)值76.22%無顯著差異，表明該響應(yīng)面模型是可行的。

2.3.4 芝麻餅粕蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的確定 選用pH 3.0～5.0對(duì)提取的芝麻餅粕蛋白質(zhì)溶液進(jìn)行沉淀，其沉淀率如圖3所示。由圖3可知，芝麻餅粕蛋白質(zhì)的沉淀率在pH 4時(shí)最高。因此，芝麻餅粕蛋白質(zhì)的最佳等電點(diǎn)為pH 4。

圖3 不同pH對(duì)芝麻餅粕蛋白質(zhì)沉淀率的影響Fig 3 Effects of different pH on protein precipitation rate

2.3.5 堿溶酸沉法制備的芝麻餅粕蛋白質(zhì)基本成分的測(cè)定 利用等電點(diǎn)沉淀法（pH為4.0）獲得的蛋白質(zhì)經(jīng)70%乙醇脫色處理后，產(chǎn)品顏色明顯變淺，呈淺灰色，芝麻餅粕蛋白質(zhì)得率為 38.11%。芝麻餅粕蛋白質(zhì)產(chǎn)品成分為粗蛋白質(zhì)58.76%，粗脂肪4.63，水分2.03%，灰分4.96，其他29.62。

3 結(jié)論

3.1 以脫脂后的芝麻餅粕為原料，采用堿溶酸沉法制備芝麻餅粕蛋白質(zhì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定最佳工藝條件為：NaOH濃度 0.37 mol/L，提取溫度75.19℃，提取時(shí)間4.7 h，液料比25.19，在此參數(shù)下芝麻餅粕蛋白質(zhì)提取率為76.22%。

3.2 通過試驗(yàn)確定芝麻餅粕蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為pH 4，經(jīng)沉淀、70%乙醇脫色、冷凍干燥后所得的芝麻餅粕蛋白質(zhì)產(chǎn)品蛋白質(zhì)含量為58.76%。

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