石莼多糖的單糖組成成分分析

馮學(xué)珍，陳穎，伍善廣*

（1.廣西科技大學(xué)，廣西 柳州545006；2.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州，510520）

海藻多糖是海洋生物多糖中種類繁多、資源較豐富的一類，其廣泛的生物活性使人們對海藻多糖的研究越來越重視，成為目前海洋藥物研究中較為活躍的領(lǐng)域之一[1-2]。石莼為綠藻石莼科植物石莼（Ulva lactuca L.）的干燥藻體，亦稱海白菜、海青菜、海萵苣等，廣泛分布在太平洋沿海，資源十分豐富?！侗静菥V目》中記載石莼具有軟堅(jiān)散結(jié)、清熱解毒、利水消腫等功效[3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石莼多糖具有抗氧化、抗菌、抗病毒和降血糖等作用[3-5]，但關(guān)于石莼多糖的單糖組成卻鮮有報(bào)道，石莼由于采集區(qū)域、采摘時(shí)期的不同，可能造成單糖組成的迥異，因此研究和改進(jìn)石莼單糖組分的測定方法為進(jìn)行多糖質(zhì)量控制和獲取多糖基本信息提供科學(xué)依據(jù)。

目前多糖的單糖組成分析方法主要有薄層色譜法（TLC）、氣相色譜法（GC）和高效液相色譜法(HPLC)等[6]。其中柱前衍生化 HPLC法因其操作簡單，分離效果好，重現(xiàn)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已成為檢測多糖中單糖組成較常用的方法[6-8]。糖類衍生的試劑 1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）可以在溫和的反應(yīng)條件下與糖醛基進(jìn)行定量反應(yīng)，生成單糖-PMP衍生物，該衍生物不易產(chǎn)生異構(gòu)峰并在250 nm波長處有強(qiáng)吸收，因此常常用PMP作為衍生化試劑用于多糖化合物的單糖組成分析[6-8]。本研究分別采用薄層色譜法和PMP柱前衍生化HPLC法對超聲提取的石莼多糖的單糖組成進(jìn)行了分析，并對兩種方法進(jìn)行了比較，為該多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石莼，采自廣西北部灣海域，經(jīng)大連海洋大學(xué)邢坤副教授鑒定為綠藻門石莼屬黑石礁石莼( Ulva lactuca L)的新鮮藻體。反復(fù)水洗幾次，以除去泥沙和鹽分等雜質(zhì)，蒸餾水洗2次，干燥、粉碎、過篩后置于干燥器中備用。

葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man)、半乳糖(Gal)、鼠李糖(Rha)、木糖（Xyl）、核糖（Rib）標(biāo)準(zhǔn)品，均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硅膠G（分析純），購自青島海洋化工廠；甲醇、乙腈均為色譜純，1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(PMP，99.0%)、三氟乙酸( TFA)、乙酸銨、氯仿、氫氧化鈉等均為分析純，水為超純水。

Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國Agilent 公司（包括 G1311C型四元泵、G1314B型VWD檢測器、AXW-8型柱溫箱等）；Diamonsil C18色譜柱 (250mm×4.6mm,5μm), 迪馬公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì), 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PHS-25 酸度計(jì),上海虹益儀器儀表有限公司；XW-80A漩渦混合器, 上海精科實(shí)業(yè)有限公司等。

1.2 石莼多糖的提取

稱取100g石莼干燥粉末，95%乙醇浸泡過夜，濾渣風(fēng)干后加50倍水，于70℃超聲波提取40min。將提取液離心，濾渣重復(fù)提取2次，合并提取液進(jìn)行減壓濃縮。濃縮液加95%乙醇沉淀2次，4℃過夜后離心干燥即得粗多糖。

將得到的粗多糖采用酶法脫蛋白3次[9]：1.0%多糖溶液加1.0%的胃蛋白酶在50℃、pH6.5條件下水解 2h，沸水浴滅酶 5min，冷卻后離心，取上清液加 95%乙醇沉淀，4℃過夜后離心干燥即得石莼多糖樣品。將樣品在波長260～280nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示無蛋白吸收峰時(shí)即表明蛋白已經(jīng)除盡。

1.3 石莼多糖的水解[8]

精密稱取30mg石莼多糖樣品于具塞試管中，加入2mol/L的三氟乙酸（TFA）2mL，封管后于110℃水解2h，冷卻至室溫離心，上清液用NaOH調(diào)pH值至7.0，定容至5mL即得石莼多糖樣品水解液[8]。

1.4 薄層色譜法

精密稱取Glc、 Man、Gal、Rha、Xyl、Rib的單糖標(biāo)準(zhǔn)品，加水制成1mg/mL的水溶液。

取單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液和石莼多糖的樣品水解液，點(diǎn)于硅膠薄層板上，以正丁醇-丙酮-水（4：3：1）為展開劑進(jìn)行展開，取出，吹干后，噴顯色劑苯胺-鄰苯二甲酸(鄰苯二甲酸1.66g溶于水飽和的正丁醇100ml，加苯胺0.93g)，置于105℃烘箱內(nèi)，顯色8min。

1.5 柱前衍生 HPLC法

1.5.1 石莼多糖樣品水解液的衍生[10]

準(zhǔn)確吸取100μL樣品水解液于離心管中，加入100μL 0.5mol/L PMP甲醇溶液及100μL 0.3mol/L NaOH溶液，渦旋混合后在70℃水浴中反應(yīng)30min[10]，取出冷卻，加100μL 0.3mol/L HCl溶液中和，再加水1mL、氯仿1mL進(jìn)行萃取，棄去氯仿層，共萃取 3 次，合并水層，水層用 0.45 μm 微孔膜過濾后供 HPLC 進(jìn)樣分析。

1.5.2 單糖標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的制備

取各種單糖（Glc、Man、Gal、Rha、Xyl、Rib）標(biāo)準(zhǔn)品用超純水配成0.05mol/L水溶液，得到6種單糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取相同體積的6種單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液即得單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取6種單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各100μL，按照“1.5.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理，0.45μm 微孔膜過濾后供 HPLC 進(jìn)樣分析。

1.5.3 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18(250mm×4.6mm, 5μm)；流動(dòng)相：A相為0.05mol/L乙酸銨緩沖溶液(pH 5. 5)，B相為乙腈；洗脫梯度（0 min, 0%B; 10min, 18%B; 25min,25%B;30min,30%B）；柱溫：30℃；流速 1.0mL/min；檢測波長：250nm。

1.5.4 方法學(xué)考察

取不同量的PMP衍生單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，在“1.5.3”色譜條件下進(jìn)樣分析，根據(jù)測定的峰面積對相應(yīng)單糖的濃度進(jìn)行數(shù)據(jù)分析即得單糖的回歸方程。再將PMP 衍生的單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液不斷稀釋，依次進(jìn)樣分析，計(jì)算信噪比為3時(shí)所對應(yīng)的6種單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度以確定最低檢測限（LOD）。

進(jìn)樣吸取單糖混合標(biāo)準(zhǔn)衍生樣品溶液10 μL在“1.5.3”色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣5次，分析6種單糖各色譜峰保留時(shí)間和峰面積值的一致性，以考察精密度。

方法重復(fù)性試驗(yàn) 按照“1.5”項(xiàng)下的方法平行制備5份石莼多糖的供試品溶液，在“1.5.3”色譜條件下進(jìn)樣分析，考察供試品的重復(fù)性。

稱取石莼多糖樣品 5份于具塞試管中，加入定量單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“1.3”“1.5.1”項(xiàng)下的方法進(jìn)行水解和衍生化操作，在“1.5.3”色譜條件下進(jìn)行色譜分析，記錄各色譜峰的峰面積，代入單糖的回歸方程，計(jì)算回收率，考察回收率。

將單糖混合標(biāo)準(zhǔn)衍生樣品溶液及石莼多糖的供試品溶液于冰箱4℃儲(chǔ)存，分別在衍生化后0、2、4、6、8、10、12h進(jìn)樣，以穩(wěn)定性考察。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法

利用Origin8.0對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2.結(jié)果

2.1 薄層色譜分析

采用薄層色譜測定石莼多糖的單糖組成結(jié)果見圖 1。根據(jù)各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的 Rf值，可以初步確定石莼多糖由鼠李糖、木糖、半乳糖、核糖、葡萄糖和甘露糖組成，但由于個(gè)別單糖的顯色斑點(diǎn)有重疊，因此難以分辨石莼多糖中可能含有的其它單糖。此法雖然操作簡單，快速，但由于多糖水解后生成的各單糖其極性比較相近，分離效果不理想。由于薄層色譜分辨率的限制，在多糖樣品中含量少的斑點(diǎn)出現(xiàn)模糊和重疊，同時(shí)該方法難以進(jìn)行定量測定。

圖1 薄層色譜法測定結(jié)果1.核糖2.葡萄糖3.半乳糖4.甘露糖5.鼠李糖6.木糖7.石莼多糖樣品Fig. 1 The results of thin layer chromatography1.Rib 2.Glc 3.Gal 4.Man 5.Rha 6.Xyl 7. samples

2.2 衍生化條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)主要考察了衍生化的溫度和時(shí)間對衍生產(chǎn)物峰面積的影響，其結(jié)果如圖所示。由圖2可以看出隨著衍生溫度（30、50、70、90、100℃）的升高，所得產(chǎn)物峰面積逐漸增大，當(dāng)衍生溫度超過70℃時(shí)，產(chǎn)物峰面積變化不大，因此選擇衍生溫度為70℃。在70℃水浴中分別衍生0.5、1、2h，由圖3可知，產(chǎn)物峰面積隨著衍生時(shí)間的延長略有增加，但是考慮到衍生時(shí)間的延長會(huì)相應(yīng)增多副產(chǎn)物，因此綜合考慮出峰時(shí)間和峰面積選擇衍生時(shí)間為0.5 h。

圖2 反應(yīng)溫度對衍生化反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on derivatization

圖3 反應(yīng)時(shí)間對衍生化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of reaction time on derivatization

2.3 單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以質(zhì)量(y)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得 6種單糖的線性回歸方程，結(jié)果見表1。由表1可見，所測定的 6種單糖的峰面積與進(jìn)樣量之間呈良好線性關(guān)系。將 PMP 衍生的單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液不斷稀釋進(jìn)樣，計(jì)算當(dāng)信噪比為 3 時(shí)所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量以確定最低檢測限（LOD），結(jié)果見表 1。結(jié)果表明， Man、Rha、Gal的 LOD 為 0.00018μg ，Xyl、Rib 的 LOD 為 0.00015μg，Glc的 LOD 為 0.00019μg。

表1 6 種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table.1 Calibration curves of six monosaccharides

2.4 方法學(xué)考察結(jié)果

2.4.1 精密度試驗(yàn)

結(jié)果表明各單糖色譜峰保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=5）為 0.07% ～0.13%；各單糖峰面積的RSD（n=5）為 0.38% ～0.95%，表明精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

結(jié)果表明衍生后石莼多糖中各色譜峰保留時(shí)間的RSD（n=5）為 0.69% ～2.25%；各色譜峰峰面積的RSD（n=5）為 2.06% ～4.15%，表明重復(fù)性較好。

2.4.3 回收率試驗(yàn)

結(jié)果如表2所示，各單糖的平均回收率為 93.78% ～97.42%，各單糖的RSD（n=5）均小于2.73。

表2 各單糖回收率試驗(yàn)Table.2 Recovery test of six monosaccharides

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

結(jié)果表明單糖混合標(biāo)準(zhǔn)樣品的各色譜峰保留時(shí)間和峰面積值的RSD（n=5）均小于2.0%，石莼多糖供試品的各色譜峰保留時(shí)間和峰面積值的 RSD（n=5）均小于 5.0%，表明樣品在衍生后12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性較好。

上述結(jié)果表明，用柱前衍生HPLC法分析石莼多糖的單糖組成，操作簡便，靈敏度高，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，可以用于石莼多糖的單糖組成測定。

2.5 PMP柱前衍生化HPLC法分析石莼多糖組成

稱取石莼多糖 3份，按“1.5”項(xiàng)下的方法進(jìn)行水解和衍生化操作，在“1.5.3”色譜條件下進(jìn)行色譜分析。將單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品圖譜與石莼多糖的圖譜對照，色譜圖見圖4。由圖4可見，衍生化后的雜質(zhì)峰出現(xiàn)在 12min之前，可與各個(gè)單糖衍生物的峰很好地分離，不影響單糖成分的分析。石莼多糖的單糖組成包括 Man、Rib、Rha、Glc、Gal 和 Xyl 6種單糖，在 30 min 內(nèi)均達(dá)到基線分離，根據(jù)分析和計(jì)算，求得石莼多糖中Man、Rib、Rha、Glc、Gal 、Xyl之間的摩爾比為：0.08:0.08:1.00:0.97:0.04:0.68。

圖4 高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of sample

3.討論與結(jié)論

海藻多糖的單糖組成分析常受到自身所含的脂肪、葉綠素、蛋白等雜質(zhì)的影響，因此多糖的提取分離是成分分析的基礎(chǔ)。本研究采用超聲波輔助提取、乙醇沉淀、酶法脫蛋白對石莼多糖進(jìn)行提取和分離。文獻(xiàn)[11]研究結(jié)果表明超聲波提取可提高工作效率，縮短提取時(shí)間，節(jié)省溶劑等優(yōu)點(diǎn)，因此本文采用超聲輔助提取了石莼多糖，縮短了提取時(shí)間，提高了提取效率。

采用薄層色譜法和PMP柱前衍生化HPLC法兩種方法分析超聲提取的石莼多糖的單糖組成，薄層色譜法結(jié)果顯示石莼多糖的單糖組成初步推斷為鼠李糖、木糖、半乳糖、核糖、葡萄糖和甘露糖組成。PMP柱前衍生化HPLC法結(jié)果顯示石莼多糖主要由鼠李糖、葡萄糖和木糖組成，此外還含有少量的甘露糖、核糖和半乳糖,各單糖 Man、Rib、Rha、Glc、Gal 、Xyl之間的摩爾比為：0.08:0.08:1.00:0.97:0.04:0.68。TLC 法雖無需衍生化處理，操作簡單，但靈敏度低，各單糖極性相近，分離效果差，因此適合于單糖組成較為簡單的多糖的定性分析，難以進(jìn)行定量測定。本文建立的超聲輔助提取—柱前衍生HPLC法分析石莼多糖單糖組成的方法操作簡單，準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，靈敏度高，取樣量少，分離效果較理想，適用于石莼多糖樣品的單糖組成測定，對進(jìn)行多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的研究具有重要價(jià)值，也可用于其它海藻多糖的單糖成分分析。

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