熒光定量PCR檢測(cè)HBV－DNA、HCV－RNA室內(nèi)質(zhì)控物的制備及評(píng)估

葛詠梅，馮曉朦，周勁松，高 申＊

熒光定量PCR檢測(cè)HBV－DNA、HCV－RNA室內(nèi)質(zhì)控物的制備及評(píng)估

葛詠梅1，馮曉朦2，周勁松2，高 申2＊

（1.吉林省人民醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院）

熒光定量PCR法檢測(cè)人血漿中乙肝HBVDNA、HCV－RNA具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的特異性［1］，但是檢測(cè)的結(jié)果易受很多因素影響，因此嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)量控制才能預(yù)防和控制檢驗(yàn)誤差，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前，PCR檢測(cè)試劑盒并未提供定值的室內(nèi)質(zhì)控品，且商用質(zhì)控品的價(jià)格昂貴、不易獲得，給常規(guī)PCR檢測(cè)過(guò)程中室內(nèi)質(zhì)量控制帶來(lái)不便。根據(jù)衛(wèi)生部臨檢中心對(duì)質(zhì)控品的相關(guān)規(guī)定，結(jié)合近年來(lái)臨床PCR工作的基礎(chǔ)，我們應(yīng)用混合血清自制單一模式的混合血清實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控品，并根據(jù)《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》（試行）等相關(guān)文件要求對(duì)其準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本采集

2012年6月—11月在我院住院和門(mén)診患者血清中，分別選取60例HBsAg、HBeAg、抗HBc陽(yáng)性、60例Hcv－Ab陽(yáng)性的患者標(biāo)本，選取200例乙肝、丙肝標(biāo)志物均陰性的患者標(biāo)本，所選取的標(biāo)本均無(wú)黃疸、溶血、脂血、高IgG。

收集的陽(yáng)性標(biāo)本于56℃水浴箱中30min滅活，離心后收集上層血清，0.5ml／支分裝，于－70℃冰箱中保存待測(cè)，避免反復(fù)凍融。

1.2主要儀器與試劑

LightCycler480熒光PCR基因擴(kuò)增檢測(cè)儀，深圳匹基生物工程有限公司的HBV－DNA、HCVRNA熒光定量PCR試劑盒。

1.3單一模式混合血清的制備

200例乙肝標(biāo)志物均陰性標(biāo)本的混合血清，作為基質(zhì)血清；60例HBsAg、HBeAg、抗HBc均陽(yáng)性標(biāo)本的混合血清，記做模式①，60例Hcv－Ab陽(yáng)性標(biāo)本的混合血清，記做模式②。將模式①，模式②的病毒濃度測(cè)定3－4次，取其平均值。用基質(zhì)血清通過(guò)1∶10、1∶100、1∶1000稀釋后，檢測(cè)3－4次，平均值及預(yù)期靶值。0.5ml／支分裝，于－70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4確定靶值繪制質(zhì)控圖

使用相同的儀器及同一品牌的試劑盒在同一反應(yīng)條件下進(jìn)行檢測(cè)，每次平行測(cè)定3個(gè)反應(yīng)，連續(xù)檢測(cè)20日，確定其靶值，計(jì)算x—、s、CV，并繪制質(zhì)控圖。

1.5均一性實(shí)驗(yàn)

任意抽取樣本各30支，進(jìn)行編號(hào)。從每支樣本中取200μl，共6ml充分混勻，用于批內(nèi)不精密度的檢測(cè)，共檢測(cè)30次。1－30號(hào)樣本分別進(jìn)行檢測(cè)，每份樣本檢測(cè)1次，計(jì)算測(cè)定（總）不精密度。該檢測(cè)為同一人操作，同一條件下，1次上機(jī)完成［2］。

1.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

1.6.1 分別取樣本各20支共40支，分為4組，每組10支包括5支HBV－DNA、5支HCV－RNA，分別按照以下放置樣本條件放置。放置條件：①室溫（20－25℃），相對(duì)濕度20%－50%，3d；②冰箱冷藏（2－8℃），5d；③－20℃14d；④－70℃（不同條件下穩(wěn)定性對(duì)照組）。

1.6.2 隨機(jī)抽取20支樣本－20℃凍存，12個(gè)月內(nèi)不定期檢測(cè)，每次抽取2支，復(fù)融，室溫放置15 min，漩渦振蕩混勻。每份樣本從核酸提取開(kāi)始平行做2份。以－70℃凍存的樣本作為長(zhǎng)期保存穩(wěn)定性對(duì)照組，與－20℃保存時(shí)的檢測(cè)值作比較，監(jiān)測(cè)制備物長(zhǎng)期保存時(shí)HBV DNA的含量變化。

1.7質(zhì)控品的評(píng)估

1.7.1 生物安全性 在本實(shí)驗(yàn)制備前，將所用血清均按照常規(guī)方法進(jìn)行56℃30min滅活備用，保證質(zhì)控血清無(wú)已知的生物傳染性。

1.7.2 質(zhì)控品的準(zhǔn)確性 本實(shí)驗(yàn)室為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室，在常規(guī)工作條件下，由熟練的技術(shù)人員對(duì)自制的質(zhì)控血清進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)衛(wèi)生部臨檢中心頒布的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品溯源定值，結(jié)果一致。

1.8統(tǒng)計(jì)分析

按文獻(xiàn)［3］方法計(jì)算x—、s、CV值。均一性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)采用方差齊性檢驗(yàn)，穩(wěn)定性試驗(yàn)檢測(cè)采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1質(zhì)控品的預(yù)期靶值

使用基質(zhì)血清稀釋的室內(nèi)質(zhì)控物的預(yù)期靶值見(jiàn)表1。

表1 最佳稀釋倍數(shù)下所測(cè)得的HBV－DNA、HCV－RNA拷貝數(shù)

2.2質(zhì)控品定值

在常規(guī)條件下，由熟練的技術(shù)人員對(duì)自制的質(zhì)控血清進(jìn)行檢測(cè)20次，計(jì)算x—、s、CV值，確定質(zhì)控品的預(yù)期靶值，詳見(jiàn)表2。

表2 自制質(zhì)控品參數(shù)

2.3均一性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

對(duì)混合樣本檢測(cè)30次的數(shù)據(jù)和30份樣本的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將兩組數(shù)據(jù)作方差齊性檢驗(yàn)，批內(nèi)精密度和總精密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F（HBV）＝1.0250、F（HCV）＝1.0240，P值均＞0.05），符合均勻性要求（表3）。

表3 均一性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同條件下放置質(zhì)控物結(jié)果P值均＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。對(duì)質(zhì)控物的穩(wěn)定性進(jìn)行長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)，12個(gè)月不定期分別對(duì)制備物HBV－DNA、 HCV－RNA監(jiān)測(cè)12次，各組間t（HBV－DNA）＝0.949，t（HCV－RNA）＝0.926，P均＞0.05，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明該定值制備物長(zhǎng)期保存含量無(wú)明顯變化。具有很好的穩(wěn)定性和長(zhǎng)期保存性（表5）。

表4 不同條件下放置質(zhì)控物結(jié)果

表5 不定期檢測(cè)HBV－DNA、HCV－RNA拷貝數(shù)

3 討論

病毒性肝炎嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，尤其是乙型肝炎在我國(guó)流行廣泛，因此肝炎的診斷和治療顯得格外重要。目前臨床實(shí)驗(yàn)室多采用熒光定量PCR方法檢測(cè)，提高HBV－DNA、HCV－RNA熒光定量PCR檢測(cè)的靈敏度與精確度，對(duì)臨床乙型肝炎的診斷及預(yù)后有極其重要的用。

為了保證熒光定量PCR法進(jìn)行病毒DNA定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性，應(yīng)嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP），建立和完善室內(nèi)質(zhì)控物，提高常規(guī)工作的批內(nèi)、批間標(biāo)本的一致性。

理想的室內(nèi)質(zhì)控樣本的條件為：基質(zhì)與待測(cè)標(biāo)本一致，所含待測(cè)物濃度應(yīng)接近試驗(yàn)的決定水平，有很好的穩(wěn)定性，靶值或預(yù)期結(jié)果已定，無(wú)已知的生物傳染危險(xiǎn)性，單批可大量獲得［4］。

本研究自制的質(zhì)控品為單一模式的混合血清，且在實(shí)驗(yàn)前經(jīng)過(guò)常規(guī)滅活，達(dá)到無(wú)生物傳染性，并在通過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室條件下，由熟練的技術(shù)員進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，該定值質(zhì)控品的測(cè)量準(zhǔn)確度不低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，具有可信度。均一性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，批內(nèi)精密度和總精密度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，自制血清穩(wěn)定，且長(zhǎng)期保存含量無(wú)明顯變化，達(dá)到國(guó)家對(duì)質(zhì)控品制備要求的相關(guān)規(guī)定。且根據(jù)《分子診斷項(xiàng)目分析性能標(biāo)準(zhǔn)》自建檢測(cè)系統(tǒng)不精密度要求：以能力驗(yàn)證／室間質(zhì)評(píng)評(píng)價(jià)界限（靶值±0.4對(duì)數(shù)值）作為允許總誤差（TEa），重復(fù)性精密度＜3／5TEa；中間精密度＜4／5TEa。按照項(xiàng)目穩(wěn)定性要求選取最長(zhǎng)期限樣品，5個(gè)樣品，覆蓋測(cè)量區(qū)間，至少4個(gè)樣品測(cè)量結(jié)果偏倚＜±7.5%，本質(zhì)控品均達(dá)到要求。

因此通過(guò)本實(shí)驗(yàn)方法自制熒光定量PCR檢測(cè)HBV－DNA、HCV－RNA的室內(nèi)質(zhì)控物，實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制提供了基本的保障，也節(jié)約了實(shí)驗(yàn)室的成本。應(yīng)用于臨床乙型、丙型肝炎的檢測(cè)的室內(nèi)質(zhì)控，為臨床出具更多及時(shí)、準(zhǔn)確的檢驗(yàn)報(bào)告，具有很大的意義。

［1］H o SK，Yam WC，Leung EK，et al.Raped quantification of hepatitisB virus DNA by real－time PCR using fluorescent hybrid ization probes［J］.J Med Microbiol，2003，52：397.

［2］王露楠，鄧 巍，申子瑜，等.乙型肝炎病毒DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究［J］.中華肝臟病雜志，2007，15（2）：107.

［3］CNAS－GL26：2008.中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在基因擴(kuò)增檢驗(yàn)領(lǐng)域的指南［S］.

［4］李金明.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2007：190.

2014－01－17）

1007－4287（2014）12－2024－03

＊通訊作者