熒光PCR檢測(cè)CYP2C19基因分型與氯吡格雷臨床療效的相關(guān)性研究

金 欣，陳水平，左向華，佟利威，袁 方，許曉躍，吳海涵，李占甲，張 偉，黃 媛，尹秀云，于 農(nóng)

熒光PCR檢測(cè)CYP2C19基因分型與氯吡格雷臨床療效的相關(guān)性研究

金 欣，陳水平，左向華，佟利威，袁 方，許曉躍，吳海涵，李占甲，張 偉，黃 媛，尹秀云，于 農(nóng)＊

（中國(guó)人民解放軍第三○七醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100071）

目的通過分析CYP2C19基因型與ADP抑制率之間的關(guān)系，探討CYP2C19基因分型與氯吡格雷抗凝治療效果的關(guān)系。方法選取急性冠脈綜合征（ACS）并成功接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)（PCI）的患者55例，收集患者EDTA抗凝靜脈血提取血液基因組DNA，用實(shí)時(shí)熒光PCR方法分析CYP2C19基因型，測(cè)定每名患者ADP抑制率，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析CYP2C19不同基因型患者ADP抑制率的差異。結(jié)果所有入組患者根據(jù)基因型不同分為快代謝組占49.09%（27／55），中等代謝組占38.19%（21／55），慢代謝組占12.73%（7／55）。三組ADP抑制率比較，兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗存在關(guān)聯(lián)，快代謝型患者PCI術(shù)后服用氯吡格雷療效好于攜帶基因突變的患者，慢代謝型患者PCI術(shù)后服用氯吡格雷療效差。

CYP2C19；氯吡格雷；熒光PCR；ADP抑制率

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1948）

抗凝藥物是心血管疾病常用的臨床藥物，氯吡格雷就是其中最具代表性的藥物之一。它是二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）受體拮抗劑，通過抑制ADP對(duì)血小板的誘導(dǎo)作用產(chǎn)生抗凝作用，是冠心病患者長(zhǎng)期服用的抗血小板聚集藥物，體內(nèi)代謝主要受基因CYP2C19調(diào)控。由于每個(gè)個(gè)體對(duì)氯吡格雷治療的反應(yīng)性不同，部分患者盡管長(zhǎng)期服用常規(guī)劑量的氯吡格雷（75mg），臨床上仍不能有效的抑制血小板聚集，不能有效的預(yù)防血栓性事件的發(fā)生，臨床常將此現(xiàn)象稱為氯吡格雷抵抗（clopidogrelresistance，CR）［1］。

本研究對(duì)心內(nèi)科接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）的患者通過熒光PCR方法檢測(cè)CYP2C19的基因型并檢測(cè)患者血栓彈力圖，通過分析CYP2C19基因型與ADP抑制率之間的關(guān)系，探討CYP2C19基因分型與氯吡格雷抗凝治療效果的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選取2013年5月－2014年7月我院心內(nèi)科住院的急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）患者55例，入選標(biāo)準(zhǔn)為：冠狀動(dòng)脈造影顯示至少一支血管狹窄程度為75%以上，并成功接受PCI治療。所有患者肝腎功能正常，術(shù)后服用硫酸氫氯吡格雷片（75mg／日）抗血小板聚集。

1.2CYP2C19基因分型血液基因組提取試劑盒為天根生化科技公司，DNA檢測(cè)試劑為蘇州曠遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的人CYP2C19基因分型檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)方法為實(shí)時(shí)熒光PCR法。取500lEDTA抗凝靜脈血，提取基因組DNA。48h內(nèi)檢測(cè)2－8℃保存，長(zhǎng)期保存－80℃。

按照試劑盒說明書在羅氏480上進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，每份標(biāo)本采用4管獨(dú)立的PCR反應(yīng)體系，分別檢測(cè)CYP2C19 681G、681A、636G、636A等位基因。結(jié)果判斷見表1。

1.3TEG血小板圖試驗(yàn)TEG血小板圖試驗(yàn)監(jiān)測(cè)氫氯吡格雷（ADP類）的抗PLTs效果，使用肝素抗凝全血測(cè)定，檢測(cè)儀器為TEG Hemostasis Ana－lyzer Model 5000Series，ADP類激活劑為原廠配套試劑。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以x—±s表示，不同基因型組間的比較采用單因素方差分析，P≤0.01差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)CYP2C19基因分型結(jié)果判讀及各組例數(shù)見表1?？齑x組占49.09%，中等代謝組占38.19%，慢代謝組占12.73%。

2.2PCI治療患者中CYP2C19基因分型與ADP抑制率之間的關(guān)系，見表2。慢代謝組7名患者ADP抑制率均小于20%，中等代謝組中95.24%的患者ADP抑制率小于50%，快代謝組中有14.81%的患者ADP抑制率小于50%，85.19%的患者ADP抑制率大于50%。

表1 實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)CYP2C19基因型結(jié)果

表2 PCI治療患者中CYP2C19基因分型與ADP抑制率之間的關(guān)系

3 討論

氯吡格雷作為一種新型的噻吩吡啶類衍生物，是一種前體藥物，需要通過氧化作用形成2－氧基－氯吡格雷，然后再經(jīng)過水解形成活性代謝物（一種硫醇衍生物）。這一活性轉(zhuǎn)化主要依賴于肝臟CYP450氧化酶作用，其中最主要的亞族為CYP2C19，使氯吡格雷在體內(nèi)有效地轉(zhuǎn)化為發(fā)揮藥物作用的活性形式。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)編碼正常酶活性的基因是CYP2C19＊1，中國(guó)人群CYP2C19突變類型幾乎均為CYP2C19＊2和CYP2C19＊3，這兩種突變是低功能代謝型，從而對(duì)氯吡格雷在體內(nèi)對(duì)抗血小板聚集療效產(chǎn)生重要影響。本研究通過檢測(cè)PCI術(shù)后患者血栓彈力圖中氯吡格雷對(duì)血小板ADP抑制率的影響，探討CYP2C19不同基因型人群與氯吡格雷抗凝療效的關(guān)系。

氯吡格雷是目前國(guó)內(nèi)唯一批準(zhǔn)上市的噻吩吡啶類抗血小板藥物，是PCI術(shù)后不可或缺的藥物之一。2011年美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)（ACC／AHA）發(fā)布的ACS患者管理指南中均建議阿司匹林及氯吡格雷雙重抗血小板藥物作為常規(guī)治療。有研究表明［2］CYP2C19＊2攜帶者在PCI支架置入術(shù)后發(fā)生支架內(nèi)血栓的概率會(huì)明顯升高。對(duì)健康受試者服用氯吡格雷的研究表明［1］，攜帶1個(gè)功能缺失等位基因的患者，其血漿氯吡格雷代謝濃度較非攜帶者降低32.4%。CYP2C19基因多態(tài)性是引起氯吡格雷抵抗的重要因素，美國(guó)食品與藥品管理局（FDA）黑框警示“使用氯吡格雷前注意CYP2C19的基因型”［3］，但有部分研究反對(duì)上述觀點(diǎn)［4，5］。研究者通過Meta分析得出CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷的臨床療效無實(shí)質(zhì)性關(guān)系［4］。

本研究對(duì)入組患者根據(jù)CYP2C19基因型的不同分成三組，CYP2C19＊1／＊1屬于野生型，是快代謝組，CYP2C19＊2／＊2，CYP2C19＊3／＊3，CYP2C19＊2／＊3這3種基因型的患者兩個(gè)等位基因同時(shí)攜帶低功能代謝基因，是慢代謝組。CYP2C19＊1／＊2，CYP2C19＊1／＊3這兩種基因型屬于中等代謝組。由于慢代謝組患者兩個(gè)等位基因同時(shí)攜帶低功能代謝基因，會(huì)導(dǎo)致氯吡格雷代謝活性降低，抗血小板聚集效果不佳，因此慢代謝組ADP抑制率會(huì)顯著低于快代謝組和中等代謝組。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6，7］，ADP誘導(dǎo)下血小板聚集50%為閾值，即ADP抑制率小于50%時(shí)患者對(duì)氯吡格雷不敏感，抗血小板聚集效果不佳，會(huì)導(dǎo)致血栓事件。本次入組的慢代謝患者ADP抑制率100%小于20%，與快代謝組和中等代謝組有顯著性差異，提示CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷抵抗存在關(guān)聯(lián)。

CYP2C19基因多態(tài)性檢測(cè)方法包括DNA直接測(cè)序法［8］、等位基因特異PCR［9］和基因芯片技術(shù)［10］等。但這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以用于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)。熒光PCR方法檢測(cè)CYP2C19靈敏性好、特異性高、操作簡(jiǎn)便，具有很好的臨床應(yīng)用前景。

總之，臨床醫(yī)師應(yīng)重視ACS患者行PCI治療后對(duì)氯吡格雷反應(yīng)的表現(xiàn)，在開始應(yīng)用氯吡格雷之前，可以考慮進(jìn)行基因檢測(cè)，在應(yīng)用氯吡格雷之后定期檢測(cè)TEG血栓彈力圖，有助于明確患者是否存在攜帶氯吡格雷低功能代謝基因，降低各類缺血事件的發(fā)生率，預(yù)防發(fā)生術(shù)后再狹窄，改善患者的預(yù)后。

［1］Mega JL，Close SL，Wiviott SD，et al.Cytochrome P－450polymorphisms and response to clopidogrel［J］.N Engl J Med，2009，360（5）：354.

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［3］FDA Drug Safety Commuication：reduced efectiveness of Plavix（elopidogre1）in patients who are poor metabolizers of the drug.US Food and Drug Administration［EB／OL］.http：／／www.fda.gov／drugs／drugsafety／Postmarket Drug Safety lnformation for Patients and Providers／ucm203888.htm.Accessed October 24，2012.

［4］Baner T，Bouman HJ，van Werkum JW，et al.Impact of CYP2C19 variant genotypes on clinical efficacy of antiplatelet treatment withclopidogrel：systematic review and meta－analysis［J］.Br Med J，2011，343：d4588.doi：10.1136／bmj d4588.

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Association between genetic polymorphisms of CYP2C19 and the clinical response to clopidogrel by fluorescence PCR

JIN Xin，CHEN Shui－ping，ZUO Xiang－h(huán)ua，et al.（Department of Clinical Laboratory，the 307th Hospital of Chinese People’s Liberation Army，Beijing100071，China）

ObjectiveTo investigate the correlation the between genotypes of CYP2C19and treatment effect of clopidogrel by analyzing the relationship between CYP2C19and the ADP inhibition rates.MethodsThe EDTA anticoagulated venous blood of 55post PCI patients who were diagnosed with acute coronary syndromes were collected，genomic DNAs were extracted and amplified by real－time fluorescent PCR，and then the ADP inhibition rates were detected.The data were analyzed by atatistical software.ResultsAccording to the different genotypes，all the patients were divided into three groups.Among the 55patients，there were 49.09%（27／55）patients with extensive metabolizer group，38.19%（21／55）patients with intermediate metabolizer group，12.73%（7／55）patients with poor metabolizer group.There were significant differences among the ADP inhibition rates of extensive metabolizer group，intermediate metabolizer group and poor metabolizer group.ConclusionThere were association between CYP2C19gene polymorphisms and clopidogrel resistance.The anticoagulant effect of clopidogrel in the CYP2C19poor metabolism genotype patients was poor.

CYP2C19；clopidogrel；fluorescence PCR；ADP inhibitory rate

R541.4

：A

金欣（1978－），女，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，研究方向：分子生物學(xué)；于農(nóng)，主任技師，主要方向：分子生物學(xué)檢驗(yàn)。

2014－07－11）

1007－4287（2014）12－1948－03

國(guó)家高技術(shù)發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）（2011AA02A109）

＊通訊作者