脂多糖應答基因?qū)ι窠?jīng)元細胞類缺血再灌注損傷的影響

鞏固 袁利邦 殷亮 蔡琳 吳畏 胡玲

脂多糖應答基因?qū)ι窠?jīng)元細胞類缺血再灌注損傷的影響

鞏固 袁利邦 殷亮 蔡琳 吳畏 胡玲

目的 研究神經(jīng)元細胞中脂多糖應答基因(LRG)的表達對細胞類缺血再灌注損傷的影響。方法將小鼠神經(jīng)元細胞分為對照組和處理組,處理組給予體外類缺血再灌注處理,采用定量PCR(qPCR)和Western blot的方法檢測細胞中LRG基因的表達。將原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞分為空白組、空載質(zhì)粒組、過表達組、非特異小干擾RNA(siRNA)組、沉默組,過表達組/沉默組轉(zhuǎn)染LRG基因過表達質(zhì)粒或siRNA,采用噻唑藍(MTT)法檢測細胞經(jīng)類缺血再灌注后的生長狀況,同時利用Western blot分析細胞中活化蛋白激酶B(p Akt)的表達。將原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞再分為陰性對照組、過表達組和抑制劑組,抑制劑組利用20μmol/L LY294002抑制細胞中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)的正常功能,MTT法分析過表達LRG基因的細胞體外生長狀況,同時利用Western blot方法分析細胞中活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3的表達。結(jié)果 與對照組相比,類缺血再灌注處理顯著降低細胞中LRG基因的表達(＜0.05)。過表達LRG基因可顯著提高缺血再灌注損傷細胞在體外的存活(＜0.05),而沉默LRG基因則降低細胞的存活(＜0.05)。同時,過表達LRG基因上調(diào)細胞中p Akt的表達而沉默LRG基因則下調(diào)p Akt的表達(＜0.05)。抑制神經(jīng)元細胞中PI3K可降低缺血再灌注損傷后細胞的存活率(＜0.05),并且提高細胞中活化caspase 3的表達(＜0.05)。結(jié)論 在神經(jīng)元細胞中過表達LRG能通過激活PI3K/Akt信號途徑降低細胞在類缺血再灌注中的損傷。

神經(jīng)元細胞；脂多糖應答基因；1-磷脂酰肌醇3-激酶；活化蛋白激酶B；再灌注損傷

脂多糖應答基因(lipopolysaccharide response gene,LRG)是最早由人牙髓細胞差異表達、基因文庫中篩選出來的基因,在多個器官中均有表達［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)LRG的表達與腦缺血耐受、神經(jīng)元細胞保護有關(guān)［3］。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)是細胞中重要的信號傳遞分子,能夠通過磷酸化下游的蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)傳遞信號［4］。PI3K/Akt的激活能對神經(jīng)元細胞產(chǎn)生保護作用［5-6］。本研究通過在神經(jīng)元細胞中過表達LRG基因,探討LRG對類缺血再灌注處理神經(jīng)元細胞的保護作用以及與PI3K/Akt的作用關(guān)系,為闡明LRG在誘導腦缺血耐受中的作用機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 新生24 h內(nèi)SPF級C57BL/6J小鼠雌雄各30只,購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑 胎牛血清、細胞培養(yǎng)基、Dy NAmo SYBR Green qPCR試劑盒、脂質(zhì)體(Lipofectamine 2000TM)均為美國Invitrogen公司產(chǎn)品,辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗和胰蛋白酶購自美國Sigma公司,兔抗LRG抗體、兔抗p Akt抗體、兔抗cleavage caspase 3抗體、兔抗β-actin抗體均為美國Santa Cluz公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 神經(jīng)元的原代培養(yǎng)：取新生24 h內(nèi)的小鼠,經(jīng)75%(體積分數(shù))乙醇消毒后斷頭取腦,分離腦海馬組織,用0.25%(質(zhì)量濃度)的胰酶結(jié)合機械吹打的方法制備單細胞懸液,調(diào)節(jié)細胞水平至106/m L,種板,于37℃,5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24～48 h后首次全量換液,培養(yǎng)到第3～4天。加入阿糖胞苷(終濃度為10μmol/L)抑制膠質(zhì)細胞生長,純化神經(jīng)元。作用1～2 d后全量換液,以后每周換液2～3次,每次半量換液。

1.3.2 神經(jīng)元類缺血再灌注處理：將原代培養(yǎng)的細胞分為對照組和處理組,類缺血再灌注按文獻［7］方法操作：將培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞或基因沉默/過表達的神經(jīng)元細胞移入37℃恒溫密閉容器中,連續(xù)充以95%(體積分數(shù))NO2+5%(體積分數(shù)) CO2混合氣體,流速為20 m L/min,持續(xù)30 min,然后復氧24 h。

1.3.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染：根據(jù)LRG基因序列,用含有HindⅢ和Bam HⅠ酶切位點的引物擴增LRG基因,將擴增產(chǎn)物克隆到p3XFlag-CMV過表達質(zhì)粒中。

1.3.4 siRNA的合成：根據(jù)LRG基因序列分別合成siRNA,并設(shè)計非特異性siRNA為陰性對照,siRNA序列由Invitrogen合成。

1.3.5 細胞轉(zhuǎn)染：為研究LRG基因表達變化對神經(jīng)元細胞存活及相關(guān)基因活化的影響,將原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞分為空白組、空載質(zhì)粒組、過表達組、非特異siRNA組和沉默組。轉(zhuǎn)染組24孔培養(yǎng)板中接種1×106神經(jīng)元細胞,去除舊培養(yǎng)基,加入500μL DMEM培養(yǎng)基。取5μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2000TM稀釋到250μL減血清培養(yǎng)基(minimum essential media,MEM)中,輕輕混勻,室溫孵育5 min；然后加入1.0μg重組質(zhì)?；?0 pmol siRNA,室溫孵育20 min。吸取50μL重組質(zhì)粒-Lipofectamine或siRNA-Lipofectamine復合物加入到細胞培養(yǎng)孔中,輕輕搖動混勻,于37℃, 5%(體積分數(shù))CO2恒溫箱培養(yǎng)24 h。各組原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞轉(zhuǎn)染后進行類缺血再灌注處理。為研究PI3 K的功能,研究將原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞分為陰性對照組、過表達組和抑制劑組,抑制劑組中細胞培養(yǎng)基中添加20μmol/L LY294002進行處理。各組細胞轉(zhuǎn)染或加抑制劑處理24 h后進行類缺血再灌注處理。

1.3.6 細胞生長檢測：采用噻唑藍﹝3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT﹞法檢測細胞生長。收集培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞,按每孔6×104個接種于96孔培養(yǎng)板,首先按步驟轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒或siRNA,然后進行MTT實驗。MTT實驗檢測分別在細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h后進行。按實驗分組每孔加入20μL MTT(5 mg/m L)后培養(yǎng)4 h。去掉上清,按照每孔150μL加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)?；靹蚝笥妹笜藘x(Bio-tek Instruments/USA)測定(測量波長為490 nm)。實驗重復3次,取平均數(shù)作為實驗結(jié)果。

1.3.7 q RT-PCR檢測基因表達水平：利用RNASolve Reagent試劑盒提取神經(jīng)元總RNA,合成cDNA。利用cDNA進行LRG基因片斷擴增,引物按照Gen Bank登錄號AF143740設(shè)計,P1：5′-CATGGCGACGCGGGTAGAGG-3′,P2：5′-CACATCAAGGAACCATCGTC-3′。內(nèi)參β-actin引物為：P1：5′-ATGGATGACGTATCGCTG-3′, P2：5′-ATGAGGTAGTTGTCAGGT-3′。擴增結(jié)束后將PCR產(chǎn)物純化、測序,采用DNAMAN分析軟件進行序列分析。采用DNA Engine OpticonTM2熒光檢測系統(tǒng)和Dy NAmo SYBR Green qPCR試劑盒進行基因表達的測定?；虮磉_定量分析采用相對標準曲線法,目的基因和β-actin基因的拷貝數(shù)分別根據(jù)產(chǎn)生的Ct值從各自的標準曲線獲得。

1.3.8 Western blot檢測蛋白表達：提取神經(jīng)元細胞總蛋白,取30μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)。電泳結(jié)束后,將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,并用1%麗春紅染色檢測轉(zhuǎn)移效果。將膜放在10 m L封閉液中(2%脫脂奶粉)1 h；加入一抗(兔抗鼠多克隆抗體,1∶1000),4℃過夜孵育；加入二抗(酶標羊抗兔單抗1∶10000)室溫孵育2 h,化學發(fā)光(ECL),暗盒曝光。膠片拍照,用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析,比較LRG、p Akt或caspase 3與βactin條帶的相對積分吸光度﹝(λ)﹞值。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件和Excel軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。數(shù)據(jù)以表示,兩組均數(shù)間比較采用 檢驗,多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析和兩兩比較(LSD法),以＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 類缺血再灌注抑制小鼠神經(jīng)元細胞LRG基因的表達 小鼠神經(jīng)元細胞復氧24 h后,與對照組相比,類缺血再灌注處理顯著降低神經(jīng)元細胞LRG mRNA(＜0.05)和蛋白的表達水平(＜0.05)(圖1,表1)。

圖1 小鼠海馬類缺血再灌注神經(jīng)元LRG基因的表達(Western blot)

表1 小鼠海馬類缺血再灌注神經(jīng)元LRG mRNA及蛋白相對表達水平分析 (±)

表1 小鼠海馬類缺血再灌注神經(jīng)元LRG mRNA及蛋白相對表達水平分析 (±)

分組mRNA相對表達量 蛋白相對表達量對照組 15 18.33±1.50 1.62±0.19處理組 15 7.91±0.84 0.90±0.13值1.24 1.52值0.032 0.037

2.2 過表達/沉默LRG基因?qū)︻惾毖俟嘧⑸窠?jīng)元細胞存活率的影響 過表達LRG基因可明顯提高神經(jīng)元細胞在類缺血再灌注處理后24 h、48 h、72 h和96 h中的存活率(=28.61,= 0.012；=18.27,=0.015；=23.48,= 0.013；=17.64,=0.015)(圖2),而LRG基因沉默則降低細胞的存活(=32.87,=0.009；=30.13,=0.009；=22.86,=0.011；= 14.97,=0.013)(圖3)。

圖2 過表達LRG基因?qū)π∈箢惾毖俟嘧⑸窠?jīng)元細胞生長的影響(MTT試驗)

圖3 沉默LRG基因?qū)π∈蠛ｑR類缺血再灌注神經(jīng)元細胞生長影響(MTT試驗)

2.3 過表達/沉默LRG基因促進/抑制Akt蛋白活化 過表達組細胞p Akt及Akt相對表達量顯著上調(diào),而基因沉默組神經(jīng)元細胞其表達則明顯降低(圖4、表2)。

2.4 抑制PI3 K的活化降低受損神經(jīng)元細胞的存活率 與陰性對照組以及過表達LRG基因組相比,抑制PI3K顯著降低細胞類缺血再灌注后24、48、72和96 h中的存活率(=27.83,=0.014；=31.21,=0.013；=28.91,=0.014；=13.46,=0.018)(圖5)。

圖4 小鼠腦海馬過表達或沉默LRG基因?qū)毎鹥 Akt蛋白的影響(Western blot)

表2 小鼠腦海馬過表達或沉默LRG基因神經(jīng)元中p Akt和Akt蛋白表達 (±)

圖5 抑制PI3K對小鼠海馬類缺血再灌注神經(jīng)元細胞生長的影響(MTT試驗)

2.5 抑制PI3K提高受損神經(jīng)元細胞中caspase 3的表達 進一步向細胞中添加PI3 K抑制物LY294002進行處理,同時過表達LRG基因,經(jīng)類缺血再灌注處理24 h后檢測活化的caspase 3基因的表達。結(jié)果顯示,與陰性對照組及過表達組相比,抑制PI3 K顯著上調(diào)神經(jīng)元細胞中裂解caspase 3的表達(圖6、表3)。

圖6 抑制PI3K對小鼠海馬類缺血再灌注神經(jīng)元細胞中caspase 3基因表達(Western blot)

表3 抑制PI3K小鼠海馬類缺血再灌注神經(jīng)元細胞中caspase 3蛋白定量分析 )

表3 抑制PI3K小鼠海馬類缺血再灌注神經(jīng)元細胞中caspase 3蛋白定量分析 )

注：與陰性對照組比較,*＜0.05；與過表達組比較,#＜0.05

分組 Procaspase 3相對表達量 Cleavage caspase 3相對表達量陰性對照組 0.81±0.09 1.78±0.21過表達組 1.70±0.20* 0.75±0.09*抑制劑組 0.78±0.08# 1.82±0.23#值11.06 15.23值0.024 0.021

3 討論

LRG是一種脂多糖(LPS)應答基因,在心、腦等多種組織中均有表達［2］。本研究結(jié)果顯示類缺血再灌注處理可明顯降低LRG基因在小鼠海馬神經(jīng)元細胞的表達,過表達LRG則明顯提高細胞類缺血再灌注處理后的體外存活率,然而利用特異siRNA沉默細胞LRG后,則導致細胞類缺血再灌注處理后體外存活率顯著降低,進一步表明過表達LRG對神經(jīng)元細胞的保護作用,而沉默LRG基因則失去這種保護作用。

目前對于原代神經(jīng)元細胞的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率沒有統(tǒng)一定論。苗宏生等［8］認為,相比于電穿孔轉(zhuǎn)染法,脂質(zhì)體DOTAP和LipofectamineTM轉(zhuǎn)染效率顯著較低,卻對細胞的損傷較小。Ohki等［9］利用脂質(zhì)體LipofectamineTM、LipofectamineTMPlus和Lipofectamine 2000TM介導對原代皮層和海馬神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)Lipofectamine 2000TM顯著提高轉(zhuǎn)染效率且對細胞傷害較小。本研究采用Lipofectamine 2000TM介導重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染效率較為理想。

前期研究發(fā)現(xiàn)LPS預處理可誘導LRG在細胞中的表達,進而改善多種器官(心臟、腦)缺血再灌注損傷后的致炎-抑炎因子之間的失衡,抑制促炎癥細胞因子的大量產(chǎn)生,誘導抗炎癥因子的釋放,減少缺血再灌注損傷［10］。然而,目前對于LRG基因?qū)ι窠?jīng)元保護的具體作用機制尚不清楚。本研究結(jié)果顯示,LRG能夠促進細胞中PI3K的活性,促進p Akt表達,而沉默LRG則導致p Akt表達減少。PI3 K/Akt信號通路是調(diào)節(jié)細胞中炎癥因子表達的重要途徑［11-12］。在單核細胞中, PI3K-Akt途徑的活化能夠抑制LPS誘導的炎癥因子的釋放,抑制PI3 K導致內(nèi)毒素中毒小鼠存活率下降［13］。在神經(jīng)元細胞中,PI3K/Akt抑制LPS誘導的誘導型一氧化氮合成酶活化以及NO的產(chǎn)生［14］,并 提高 抗 凋 亡 作 用［15］。本 研 究 利 用LY294002抑制PI3K的功能,結(jié)果發(fā)現(xiàn)LRG基因失去對類缺血再灌注處理中神經(jīng)元的保護作用,表明PI3K是LRG基因發(fā)揮保護作用所必需的。

細胞中caspase 3的活化是誘導細胞凋亡的關(guān)鍵步驟［16-17］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)類缺血再灌注處理后Cleavage caspase 3表達明顯升高,表明抑制PI3K能夠增加神經(jīng)元在類缺血再灌注后的凋亡,同時也表明抑制PI3K使LRG失去對細胞的保護作用。

綜上所述,類缺血再灌注能夠誘導細胞損傷并降低神經(jīng)元細胞中LRG基因的表達,而過表達LRG基因能誘導對神經(jīng)元的保護作用,并且這種保護作用是通過激活PI3 K/Akt信號途徑來進行的,抑制PI3 K的功能可阻礙LRG的作用并提高神經(jīng)元凋亡水平。缺血耐受涉及到神經(jīng)元細胞中各種基因以及信號分子間的相互作用［18-19］,對于LRG基因是如何誘導對細胞的保護作用還需進一步實驗研究。

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GONG Gu,Email：gugongcd@163.com

Objective To investigate the effect of lipopolysaccharide respond gene(LRG)on neuron ischemia-reperfusion injury.Methods Cultured neurons were challenged with ischemia-reperfusion condition, and LRG expression were detected by qPCR and Western blot.LRG overexpression plasmid or specific siRNA were transferred into neurons prior to ischemia-reperfusion and cell survival was detected by 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)assay.Meanwhile,the expression of phosphated Akt was analyzed by Western blot.Furthermore,specific phosphatidylinositol-3-kinase(PI3 K) inhibitor(LY294002,20μmol/L)was added in LRG overexpressed neurons,and cell survival was determined with MTT assay.In addition,active caspase 3 was analyzed by Western blot.Results Ischemia-reperfusion conditioning significantly decreased LRG expression in neurons(＜0.05).LRG overexpression promoted survival of neurons while knockdown of LRG led to a decreased survival(＜0.05).Furthermore,LRG overexpression evidently up-regulated the expression of phosphated Akt(＜0.05).Besides,inhibition of PI3K contributed to a lower survival(＜0.05)and an augmented expression of active caspase 3 in neurons(＜0.05).Conclusions Overexpression of LRG in neuron may attenuate ischemia-reperfusion injury through PI3K/ Akt pathway.

neuron；lipopolysaccharide respond gene；1-phosphatidylinostol 3-kinase；activated protein kinase；reperfusion injury

R741.02

：A

：1006-2963(2014)05-0335-05

2013-11-24)

(本文編輯：時秋寬)

10.3969/j.issn.1006-2963.2014.05.008

四川省衛(wèi)生廳課題資助項目(110469)

610083成都軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科

鞏固,Email：gugongcd@163.com