電針對兔膝骨關(guān)節(jié)炎家兔模型軟骨細胞凋亡的影響*

彭支蓮 黃 劍 韋桂勇 肖 龍 袁海洲

（1.重慶市九龍坡區(qū)中醫(yī)院，重慶 400080；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016）

電針對兔膝骨關(guān)節(jié)炎家兔模型軟骨細胞凋亡的影響*

彭支蓮1黃 劍2△韋桂勇2肖 龍2袁海洲2

（1.重慶市九龍坡區(qū)中醫(yī)院，重慶 400080；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016）

目的觀察電針對兔膝骨關(guān)節(jié)炎家兔模型軟骨細胞凋亡的影響。方法40只新西蘭大白兔隨機分成空白對照組、模型組、電針組和西藥組。除空白對照組外，各組動物采用左后肢膝關(guān)節(jié)伸直位石膏固定7周建立膝骨關(guān)節(jié)炎動物模型。造模成功后，電針組取左后肢梁丘、血海、陽陵泉、足三里和內(nèi)外膝眼6個穴位，用毫針斜刺或直刺得氣后，進行電針操作，連續(xù)治療3周；西藥組灌服氨基葡萄糖膠囊，治療3周。處理前后，對各組家兔膝關(guān)節(jié)滑膜和軟骨標本，進行HE染色、免疫組化法染色觀察膝關(guān)節(jié)滑膜和軟骨的病理變化；采用TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡并計算凋亡指數(shù)（AI）。結(jié)果經(jīng)治療后，電針組和西藥組關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡、凋亡指數(shù)與模型組比較明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論電針能改善膝骨關(guān)節(jié)炎家兔模型軟骨細胞的過度凋亡，降低膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨細胞的凋亡率。

電針 膝骨關(guān)節(jié)炎 軟骨細胞 凋亡

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（KOA）是由于關(guān)節(jié)滑膜退變，軟骨破壞引起，以膝關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和活動受限為特征，為臨床常見病。隨著年齡的增長和人口老齡化的趨勢，KOA的發(fā)病逐年增高，對本病的研究和治療近年來引起臨床醫(yī)師的重視。針灸（針刺、溫針、電針等）治療KOA早期、中期膝骨關(guān)節(jié)炎有較好療效，但缺乏臨床數(shù)據(jù)資料，尤其缺少對針灸治療KOA的機理研究資料?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 新西蘭雄性大白兔40只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為：SYXK（渝）2012-0001。隨機將動物分為空白對照組、模型組、電針組和西藥組，每組10只。

1.2 實驗儀器及試劑 BX40型光學(xué)顯微鏡，BX51型倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。電針儀（SDZ-Ⅱ型華佗牌6805-β）。TUNEL試劑盒，購于美國Roche公司。

1.3 建立動物模型 實驗動物同等條件下穩(wěn)定飼養(yǎng)7 d后，將40只新西蘭大白兔隨機選取30只兔子按照膝關(guān)節(jié)石膏制動法造模［1］。造模成功，拆去石膏外固定。

1.4 電針方法 造模成功后，參照《實驗針灸學(xué)》［2］和《實驗動物針灸手冊》［3］，將電針組動物選取梁丘、血海、陽陵泉、足三里和內(nèi)外膝眼6個穴位。常規(guī)酒精消毒后，用1寸毫針直刺或斜刺5～15 mm，待針下出現(xiàn)得氣感后，選取4個兩組穴位接電針治療儀，疏密波，頻率2～100 Hz，以局部皮膚肌肉輕微顫動為度，每次留針25 min，每日1次，連續(xù)治療3周。西藥組灌服氨基葡萄糖膠囊，每日 90 mg/kg，共3周［4］；空白對照組和模型組正常飼養(yǎng)，不做干預(yù)。

1.5 標本采集 造模7周后，從空白對照組和造模組動物中隨機分別取出1只和3只兔處死，解剖兔膝關(guān)節(jié)取出滑膜和軟骨標本，作病理檢測，觀察動物造模情況。治療結(jié)束后，處死各組動物，采集兔膝關(guān)節(jié)滑膜，脛骨平臺內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)面的完整軟骨及軟骨下骨組織標本，用10％的甲醛溶液固定，常規(guī)切片，HE染色作病理檢測，其余軟骨切片作軟骨細胞凋亡檢測。

1.6 軟骨細胞凋亡測定 治療結(jié)束后處死各組動物，解剖左側(cè)膝關(guān)節(jié)，用銳刀片切1 cm×1 cm取股骨內(nèi)髁全層軟骨標本，置于10％多聚甲醛固定48 h后，常規(guī)切片，厚度為5 μm，置于40℃水浴展片，撈片后于60℃烘箱中烘片2 h以使切片緊密黏附，按照試劑盒說明，采用原位末端標記法（TUNEL）測定軟骨細胞凋亡。陽性判定：細胞核為棕黃色顆粒.每張切片隨機選取5個視野，計數(shù)陽性細胞和總細胞數(shù)，細胞凋亡指數(shù)（AI）＝TUNEL標記陽性細胞數(shù)/軟骨細胞數(shù)×100％。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，組間差異采用方差分析（ANOVA），行F檢驗及Q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色光鏡下觀察兔膝關(guān)節(jié)滑膜與軟骨病理變化 見圖1～圖5。7周后，從未造模和造模動物中隨機分別取出1只和3只兔處死，解剖兔膝關(guān)節(jié)取出滑膜和軟骨標本。采用HE染色，常規(guī)病理切片，觀察發(fā)現(xiàn)未造模動物膝關(guān)節(jié)滑膜無增厚（圖1），軟骨細胞排列均勻，無增生，軟骨邊緣光滑，層次清楚（圖2）。造模動物膝關(guān)節(jié)滑膜增厚（圖3），軟骨細胞排列不均，邊緣破壞，粗造不平（圖4）。治療結(jié)束后，處死各組動物，采集膝關(guān)節(jié)軟骨標本，HE染色，光鏡下見空白對照組膝關(guān)節(jié)軟骨細胞排列均勻，無增生，軟骨邊緣光滑，層次清楚，模型組動物膝關(guān)節(jié)表面細胞排列不均，邊緣破壞明顯，軟骨細胞增生較少；電針組和西藥組動物膝關(guān)節(jié)軟骨表面較光滑，邊緣破壞較輕，有大量軟骨細胞增生（圖 5）。

2.2 TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡 見圖6。切片顯示，空白對照組軟骨細胞很少見到TUNEL標記陽性細胞，各時間段均未檢出兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞的異常凋亡。造模7周后，造模動物關(guān)節(jié)軟骨各層可見大量棕黃色TUNEL標記陽性細胞，軟骨細胞均過度凋亡。治療結(jié)束后，造模組動物TUNEL標記陽性細胞明顯增加，軟骨細胞過度凋亡；電針組動物軟骨細胞凋亡較治療前減少，TUNEL標記陽性細胞與模型組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；西藥組動物軟骨細胞凋亡較處理前減少，與電針組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 （HE，×400）

圖2 （HE，×400）

圖3 （HE，×400）

圖4 （HE，×400）

圖5對照組 （HE，×400）

圖5模型組（HE，×400）

圖5 電針組（HE，×400）

圖5西藥組（HE，×400）

圖6 空白對照組動物軟骨細胞TUNEL標記陽性細胞較少，散在分布于淺中層。模型組軟骨細胞TUNEL標記陽性細胞明顯增多，淺中深層均有較多表達。

2.3 各組動物軟骨細胞凋亡指數(shù) 見表1。治療結(jié)束后，取各組動物軟骨標本，采用原位末端標記法（TUNEL）測定軟骨細胞凋亡。每張切片隨機選取5個視野，計數(shù)陽性細胞和總細胞數(shù)，細胞凋亡指數(shù)（AI）= TUNEL標記陽性細胞數(shù)/軟骨細胞數(shù)×100％。

3 討論

表1 各組TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡指數(shù)（％，±s）

表1 各組TUNEL法檢測軟骨細胞凋亡指數(shù)（％，±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與治療前比較，#P＜0.05。

組 別 n 治療前 治療后對照組 10 3.12±0.342 3.06±0.356模型組 10 4.27±0.401* 4.69±0.528*電針組 10 4.27±0.401* 3.81±0.390△#西藥組 10 4.27±0.401* 3.92+0.319△#

凋亡又稱為程序性死亡，是指多細胞生物體有核細胞在基因控制下，遵循自身程序而發(fā)生的自然死亡過程，以清除無功能的細胞、受損害的細胞或衰老細胞，從而維持機體內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定。早期研究表明，骨關(guān)節(jié)炎（OA）患者關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細胞數(shù)少于正常關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細胞數(shù)，部分軟骨細胞發(fā)生死亡，進一步研究表明 OA時軟骨細胞死亡的主要方式是凋亡［5］。Blanco等人通過透射電鏡，流式細胞儀技術(shù)及TUNEL法對正常人及OA患者關(guān)節(jié)軟骨進行研究，證實了與正常人的軟骨相比，OA患者軟骨的軟骨細胞凋亡明顯增多（51％），且凋亡細胞主要位于軟骨表層和中層［6］。凋亡的軟骨細胞區(qū)域蛋白多糖降解明顯，軟骨細胞凋亡的數(shù)量與軟骨基質(zhì)的降解程度相關(guān)，提示凋亡細胞數(shù)目與OA嚴重程度是相關(guān)的［7］。這些研究表明軟骨細胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病中有重要作用，為抑制軟骨細胞凋亡作為治療手段提供了依據(jù)。

骨關(guān)節(jié)炎屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”、“痿證”范疇。膝骨關(guān)節(jié)炎多發(fā)于中老年人，中醫(yī)學(xué)認為中老年人氣血不足、陰陽失衡、臟腑虧虛，氣虛血瘀、陽虛寒濕停聚膝關(guān)節(jié)，致筋脈拘急，關(guān)節(jié)屈伸不利，骨骼變形，形成骨痹。本病病位在肝、腎、筋、骨，病性為本虛標實，虛實夾雜；病機為肝腎虧虛，痰瘀阻絡(luò)，筋骨失養(yǎng)。中醫(yī)學(xué)認為膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病是肝、脾、腎虧虛，風(fēng)、寒、濕及瘀血阻于局部，致經(jīng)絡(luò)痹阻不通而發(fā)疼痛，為本虛標實之證。針灸治療膝骨關(guān)節(jié)炎的方法主要有針刺、溫針及電針。取穴原則以局部和經(jīng)絡(luò)辨證取穴為主。臨床上患者常因膝痛發(fā)作而就診，故疾病多為邪盛標實，寒濕盛為主要矛盾，因此臨床辨證為寒濕證者較多［8］。故臨床取穴多以足太陰脾經(jīng)和足陽明胃經(jīng)腧穴為主，較少取足厥陰肝經(jīng)和足少陰腎經(jīng)等穴。筋會陽陵，膝為筋府，故陽陵泉善治膝病。血海屬足太陰脾經(jīng)穴，具有活血化瘀之效，與陽陵泉配伍有舒筋活血、通絡(luò)止痛的作用，主治膝關(guān)節(jié)痛。陽明經(jīng)為多氣多血之經(jīng)，有主潤宗筋，主束骨而利關(guān)節(jié)的作用。足三里為足陽明經(jīng)合穴，具有補益肝腎、濡潤宗筋、溫經(jīng)散寒止痛之功，主治下肢痿弱不收，是治療下肢痿痹的要穴。梁丘為足陽明經(jīng)郄穴，具有舒筋活絡(luò)的功效，與陽陵泉配伍主治膝關(guān)節(jié)痛、筋攣和膝關(guān)節(jié)屈伸不利。梁丘與足三里配伍加溫針灸，可達溫經(jīng)通脈、散寒除濕、活血止痛、扶正祛邪、標本兼治之功。電針足三里穴可使血行風(fēng)滅，筋脈得養(yǎng)，宗筋復(fù)健，關(guān)節(jié)流利。本實驗中，兔骨關(guān)節(jié)炎模型給予電針干預(yù)后，該組動物軟骨細胞的凋亡率下降，這可能是電針抑制軟骨細胞凋亡的機制之一，有關(guān)電針抑制軟骨細胞凋亡的確切機制，還有待進一步探討。

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Effects of Electroacupuncture（EA）on Chondrocyte Apoptosis in Rabbit Model with Knee Osteoarthritis

PEN Zhilian，HUANG Jian，WEI Guiyong，et al.TCM Hospital of Jiulongpo District，Chongqing 400080，China

Objective：To study the effects of electroacupuncture（EA）on chondrocyte apoptosis in rabbit model with Knee Osteoarthritis（KOA）.Methods：A total of 40 New Zealand rabbits were randomly divided into control，model，EA and western medicine groups.KOA model was established by gypsum fixing method.EA was applied to left"Liangqiu"（ST 34），"Xuehai"（SP 10），"Yanglingquan"（GB-34），"Zusanli"（ST 36）and"Xiyan"（EX-LE 5）for 25 min，once daily and continuously for 3 weeks.Western medicine groups was fed with Glucosamine capsule 90 mg/（kg·d）for 3 weeks.The cartilage specimen was collected to detect chondrocyte apoptosis by TUNEL.Results：After treatment，levels of chondrocyte apoptosis in EA and western medicine groups decreased considerably compared with model group，and there was obvious（P＜0.05）.Conclusions：The electroacupuncture can effectively improve excessive chondrocyte apoptosis in rabbits with KOA and decrease the rate of chondrocyte apoptosis.

Electroacupuncture；Knee Osteoarthritis；Chondrocyte；Apoptosis

R245.9+7

A

1004-745X（2014）08-1428-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.013

2014-03-17）

重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科技項目；重慶市九龍坡區(qū)科委項目（2012-32）

△通信作者