冠脈結(jié)扎法建立大鼠急性心肌梗死模型方法的探討*

張 凱 謝世陽 王幼平 劉衛(wèi)紅 李 彬 朱明軍△

（1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008）

·研究報(bào)告·

冠脈結(jié)扎法建立大鼠急性心肌梗死模型方法的探討*

張 凱1，2謝世陽1王幼平1劉衛(wèi)紅1李 彬1朱明軍1△

（1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008）

目的建立一種方便、省時(shí)、死亡率低且穩(wěn)定的急性心肌梗死模型制作方法。方法雄性成年Sprague· Dawley大鼠麻醉后在呼吸機(jī)支持下，于相應(yīng)第3、4脅間隙處開胸，擠壓兩側(cè)胸壁，將心臟擠出于胸腔外，通過結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，建立心肌梗死模型。通過觀察術(shù)后大鼠心電圖的變化，以及分別利用Evan blue染色及病理組織學(xué)方法于術(shù)后3 h及1周，確定心肌缺血及梗死范圍，同時(shí)觀察術(shù)中、術(shù)后24 h及1周大鼠的存活率。結(jié)果術(shù)后大鼠Ⅰ、Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段明顯抬高。術(shù)后3 h大鼠心臟Evan blue染色顯示心肌缺血區(qū)恒定。術(shù)后1周處死取出大鼠心臟，可見心臟前壁、側(cè)壁及心尖處形成境界清晰的心肌梗死區(qū)，梗死區(qū)顏色明顯淺于周圍的心肌，呈蒼白色，失去正常光澤。術(shù)后1周大鼠心肌組織HE染色，可見梗死區(qū)伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。造模成功率為83％，術(shù)后24 h存活率為77％，術(shù)后1周大鼠總存活率為72％。結(jié)論此模型操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，且術(shù)后動(dòng)物存活率高，是研究心肌梗死較理想的模型。

大鼠 心肌梗死 冠狀動(dòng)脈 結(jié)扎 造模

冠心病是危害人類健康的常見心血管疾病之一。冠心病心肌梗死因發(fā)病急、病死率高而對(duì)人類的危害甚大。在針對(duì)心肌梗死的基礎(chǔ)研究中，動(dòng)物模型的建立是進(jìn)行該研究的基本保障。目前采用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制作急性心肌梗死動(dòng)物模型是最常用的一種方法［1］，其與臨床心肌梗死的病理生理過程非常相似［2］。通過查閱國(guó)內(nèi)外大量文獻(xiàn)，筆者發(fā)現(xiàn)采用結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制作急性心肌梗死模型在結(jié)扎方法上多集中于開胸后胸腔內(nèi)結(jié)扎和開胸?cái)D出心臟體外結(jié)扎兩種，對(duì)于這兩種方法的大鼠成活率、模型穩(wěn)定性報(bào)道不一［3-4］。筆者通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以存活率、穩(wěn)定性和造模時(shí)間等幾方面考慮，采用開胸?cái)D出心臟體外結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支制作大鼠急性心肌梗死模型的方法值得推薦?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠 60只，體質(zhì)量（220±30）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。

1.2 主要儀器及試劑 小型動(dòng)物呼吸機(jī)（美國(guó)Havard Model 680型），心電圖機(jī)（澳大利亞埃德公司ML870Br型），外科剪刀、止血鉗、小鑷子、醫(yī)用縫合針等手術(shù)器械，伊文氏藍(lán)（美國(guó)Sigma公司），水合氯醛（天津福晨化學(xué)試劑廠）超純水配制成10％溶液，慶大霉素針（武漢遠(yuǎn)大制藥集團(tuán)股份有限公司）。

1.3 大鼠造模前準(zhǔn)備 術(shù)前禁食12 h；大鼠稱質(zhì)量，用10％水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉（0.1 mL/100 g），大鼠胸部手術(shù)區(qū)備皮及皮膚常規(guī)消毒。

1.4 胸腔外結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈造模 見圖1。經(jīng)腹腔麻醉后，將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)板上，連接心電圖，并使用燈光照射保暖。用橡皮筋掛住大鼠門牙，使大鼠頭向后仰，將氣管插管插入大鼠氣管，插管后膠布固定，連接呼吸機(jī)，呼吸機(jī)頻率為60次/min，潮氣量3 mL/100 g。于大鼠心尖搏動(dòng)最強(qiáng)點(diǎn)的上一肋間，相應(yīng)于第3、4脅間間隙處為切口位置，橫向剪開皮膚，首先沿切口穿線以備術(shù)末做荷包縫合。隨后用止血鉗鈍性分離皮下組織及肌層，分離肋間肌，注意沿肌肉紋理分離，并深入穿破胸膜，擠壓兩側(cè)胸壁，把心臟擠出胸腔。將心尖向上推起固定，在肺動(dòng)脈圓錐和左心耳下緣約1 mm處，用醫(yī)用縫合線連同一束心肌結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，結(jié)扎完成后迅速將心臟復(fù)位，當(dāng)見結(jié)扎線以下心肌顏色改變同時(shí)伴隨心臟博動(dòng)減弱，體表心電圖出現(xiàn)明顯ST段抬高后，說明結(jié)扎冠脈成功，隨后擠出胸腔內(nèi)氣體，拉緊荷包縫合。待大鼠恢復(fù)自主呼吸，狀態(tài)平穩(wěn)后，停用呼吸機(jī)，拔除氣管內(nèi)插管，造模結(jié)束。

圖1 大鼠胸腔外結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈造模過程

1.5 術(shù)后一般處理和觀察 術(shù)后將大鼠置于電熱毯上保溫，予術(shù)后抗感染治療：慶大霉素（2 mL∶8萬U）腹腔注射，每日1次，每次0.2 mL，連續(xù)給藥3 d。觀察大鼠術(shù)中、術(shù)后24 h及1周大鼠存活率。

1.6 大鼠心肌缺血范圍觀察 大鼠心肌梗死模型建立成功，術(shù)后3 h處死大鼠，立即經(jīng)頸動(dòng)脈插管注入l％伊文氏藍(lán)2 mL，觀察大鼠心臟染色情況；大鼠心梗模型建立成功后，喂養(yǎng)1周，處死大鼠，開胸取出心臟，肉眼觀察大鼠心臟形態(tài)改變。

1.7 大鼠心臟組織形態(tài)學(xué)觀察 大鼠心梗模型建立成功后，喂養(yǎng)1周，處死大鼠，開胸取出心臟，于冰生理鹽水中洗去血液，用10％甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋切片，行HE染色后，鏡下觀察大鼠梗死區(qū)心肌組織形態(tài)變化。

2 結(jié)果

2.1 大鼠冠脈結(jié)扎前、后心電圖的變化 見圖2。動(dòng)態(tài)觀察手術(shù)前、后Ⅰ、Ⅱ?qū)?lián)心電圖的改變?？梢娦g(shù)后Ⅰ、Ⅱ?qū)?lián)ST段均出現(xiàn)了明顯的抬高。

圖2 大鼠冠脈結(jié)扎前、后心電圖的變化

2.2 術(shù)中及術(shù)后大鼠存活率 在本實(shí)驗(yàn)中，所有手術(shù)均在5～10 min內(nèi)完成，60只SD大鼠，術(shù)中死亡10只，造模成功率為83％，術(shù)后24 h內(nèi)死亡4只，術(shù)后24 h存活率為77％，至術(shù)后1周實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，共成活43只，術(shù)后1周總存活率為72％。

2.3 大鼠心肌缺血及梗死范圍觀察 見圖3。術(shù)后3 h大鼠心臟經(jīng)伊文氏藍(lán)染色可見，紅色為缺血心肌，藍(lán)色為正常心肌。術(shù)后1周大鼠心臟，可見心臟前壁、側(cè)壁及心尖處形成境界清晰的心肌梗死區(qū)，梗死區(qū)顏色明顯淺于周圍的心肌，呈蒼白色，失去正常光澤。

圖3 大鼠心肌缺血及梗死范圍觀察

2.4 術(shù)后1周心肌形態(tài)觀察 見圖4。心梗術(shù)后1周，大鼠心肌組織HE染色顯示，梗死區(qū)伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖4 術(shù)后1周心肌形態(tài)觀察

3 討論

目前，使用大鼠建立心肌梗死模型的方法趨于成熟，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外已普遍使用。傳統(tǒng)的胸腔內(nèi)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈造模方法，由于實(shí)驗(yàn)操作的過程復(fù)雜、耗時(shí)、創(chuàng)傷大，且出血多，因而導(dǎo)致大鼠恢復(fù)較慢，極易造成死亡，成功率低。然而，胸腔外擠出心臟結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈造模方法，省時(shí)且對(duì)大鼠機(jī)體損害小，故明顯減少了大鼠的死亡率，提高了造模成功率。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道大鼠心肌梗死造模術(shù)后24 h存活率為40％～60％［5-6］，本方法造模成功率為83％，術(shù)后24 h存活率為77％。

麻醉是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)必不可少的步驟，麻醉也是關(guān)系到造模成功與否的重要因素。對(duì)大鼠的麻醉大多采用吸入麻醉和藥物注射麻醉。吸入麻醉常用的有乙醚［7］、藥物注射麻醉常用的有氯胺酮、戊巴比妥鈉［8］、水合氯醛［9］，而藥物注射麻醉常為制作心肌梗死模型的主要方法［10］。筆者在早期實(shí)驗(yàn)研究過程中使用3％戊巴比妥鈉（1.0 mL/kg）麻醉大鼠，發(fā)現(xiàn)戊巴比妥鈉麻醉后，大鼠復(fù)蘇時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，自主呼吸恢復(fù)較慢，并且麻醉后易致大鼠呼吸道分泌物明顯增多，如不及時(shí)清理，大鼠很容易發(fā)生窒息。采用10％水合氯醛麻醉后大鼠呼吸道分泌物較戊巴比妥鈉麻醉大鼠少、起效快，對(duì)動(dòng)物呼吸頻率、體溫及心率的影響小，顯著降低了大鼠術(shù)中的死亡率。

術(shù)中及術(shù)后注意給予大鼠保溫。由于大鼠術(shù)中受到較大的手術(shù)創(chuàng)傷，機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)，大鼠在術(shù)中及術(shù)后時(shí)常伴發(fā)低體溫，對(duì)大鼠機(jī)體的生理功能有很大影響，增加了死亡率，因此在術(shù)中對(duì)大鼠進(jìn)行燈光照射保暖，特別對(duì)術(shù)中出血的大鼠尤為重要。術(shù)后的保溫，不但縮短了大鼠的蘇醒時(shí)間，而且明顯提高了存活率。王小慶等報(bào)道，將麻醉后6 h內(nèi)的大鼠置于20℃以下室溫的環(huán)境中可明顯增加動(dòng)物的死亡率，尤其對(duì)麻醉尚未蘇醒的動(dòng)物。因此良好的術(shù)中、術(shù)后處理可以提高動(dòng)物模型的生存率［11］。

擠出心臟于胸腔外結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈的造模方法使建立大鼠心肌梗死模型時(shí)間明顯減少。在本實(shí)驗(yàn)中，所有手術(shù)均在5～10 min內(nèi)完成，不僅提高了工作效率，而且由于結(jié)扎時(shí)間縮短還可減少心律失常的發(fā)生，從而減少了術(shù)中大鼠死亡。Garikipati Venkata NS等［12］報(bào)道，大鼠心肌梗死模型手術(shù)過程需要20 min。

在擠出心臟于胸腔外結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈造模過程中，以止血鉗鈍性分離肋間肌進(jìn)胸，不需剪斷肋骨，能較好地保持胸部正常解剖結(jié)構(gòu)，不僅有利于自主呼吸的恢復(fù)，還由于心臟被擠出能充分暴露手術(shù)視野，便于固定，減少了心臟跳動(dòng)對(duì)結(jié)扎的影響，提高了冠脈結(jié)扎的準(zhǔn)確性，減少了由于心臟和大血管受到牽拉而發(fā)生的急性心律失常，降低了造模死亡率。然而，在胸內(nèi)結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈造模過程中需要剪斷肋骨，剪斷的肋骨容易造成進(jìn)一步的肺損傷，以及在開胸及結(jié)扎冠脈時(shí)需拉開肺組織，稍有不慎，手術(shù)器械就有可能損傷肺組織，從而影響術(shù)后呼吸功能。另外，由于大鼠無縱隔結(jié)構(gòu)，開胸也易造成開放型氣胸。

結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈造模手術(shù)，由于涉及大鼠心、肺臟器，一旦發(fā)生感染將增加模型的死亡率。然而，擠出心臟于胸腔外結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈造模方法，由于手術(shù)傷口小，可大幅度減少大鼠感染機(jī)會(huì)。

總之，筆者在綜合以往建立大鼠心肌梗死模型方法的基礎(chǔ)上，對(duì)麻醉方法、手術(shù)方式及術(shù)后處理進(jìn)行改進(jìn)，建立了一種較理想的大鼠心肌梗死動(dòng)物模型。本方法操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、術(shù)后存活率高、模型穩(wěn)定，可用于心肌梗死的發(fā)病機(jī)制、藥物治療等方面的研究。

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Evaluation of Rat Model of Myocardial Infarction Induced by Ligation of Coron-ary Artery

ZHANG Kai，XIE Shiyang，WANG Youping，et al. First Affiliated Hospital of Henan University of TCM，Henan，Zhengzhou 450000，China

Objective：To build a rat model of acute myocardial infarction characterized by convenience，timesaving，stabilization，and low mortality.Methods：After male adult Sprague-Dawley rats were anesthetized and ventilated，left-sided thoracotomy was performed between the third and fourth intercostal spaces.The left anterior descending coronary artery was ligated following the heart was rapidly exteriorized.The ligation of LAD was verified by the use of electrocardiogram（ECG）.We evaluated myocardial infarction using Evan blue staining and histological studies 3 hours and 1 week after myocardial infarction.The survival rate was determined during the period of surgery，24 hours and 1 week after myocardial infarction.Results：ECG showed that the S-T segment elevation was seen in lead I and II immediately after ligation of LAD.Evan blue staining demonstrated that the ischemic area was consistent 3 hours after myocardial infarction.The infarcted myocardium was found to be thick and pale 1 week after myocardial infarction.The infarcted myocardium with inflammatory cell infiltration was shown in HE staining.The survival rate was 83％，77％，and 72％during the period of surgery，24 hours，and 1 week after myocardial infarction，respectively.Conclusions：This model with the characterization of simplicity，stabilization，and low mortality may be suitable for studying myocardial infarction.

Rat；Myocardial infarction；Coronary artery；Ligation；Molding

R285.5

A

1004-745X（2014）08-1397-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.08.001

2014-05-04）

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173410）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81373853）；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃（13IRTSTHN012）

△通信作者