超早期針刺百會、水溝對急性腦缺血大鼠GLUT1、GLUT3的影響*

黃 偉 姜功道 李 佳吳 松

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430000；2.湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061）

超早期針刺百會、水溝對急性腦缺血大鼠GLUT1、GLUT3的影響*

黃 偉1，2姜功道1，2李 佳1△吳 松1

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430000；2.湖北省中醫(yī)院，湖北 武漢 430061）

目的在前期采用microPET觀察到超早期針刺對腦缺血葡萄糖代謝改善的基礎(chǔ)上，從能量代謝角度進一步探討針刺抗腦缺血損傷的作用機理。方法采用微創(chuàng)開顱電凝法制作大鼠急性腦缺血模型，隨機數(shù)字表法分為4組：正常組、模型組、穴位組、非穴位組，每組10只。穴位針刺取百會、水溝針刺（頻率120次/min，捻轉(zhuǎn)瀉法1min，每次5min，留針30min）。非穴位針刺分別在百會、水溝左側(cè)旁開5mm處進針，避開穴位，手法同穴位針刺。采用免疫組織化學(xué)法檢測缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)域GLUT1、GLUT3的表達。結(jié)果造模成功后，缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)域GLUT1、GLUT3含量在大鼠腦缺血后明顯下降，與正常組比較，有極顯著性差異（P＜0.01）；穴位組大鼠GLUT1、GLUT3含量較模型組及非穴位組比較明顯升高（P＜0.05）；而非穴位組與模型組水平接近（P＞0.05）。結(jié)論穴位針刺可以有效調(diào)節(jié)腦缺血大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)域GLUT1、GLUT3的表達，改善能量代謝，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用，進一步為臨床針刺抗腦缺血提供實驗依據(jù)。

針刺腦缺血能量代謝百會穴水溝穴

腦血管病是針灸療法的主要適應(yīng)證，但針刺對缺血區(qū)域的能量代謝的作用機制還不明確。腦缺血損傷后需氧代謝衰減，無氧酵解增強，很快進入衰竭期，引起興奮性氨基酸釋放，發(fā)生早期腦水腫、腦功能活動障礙，繼而發(fā)生一系列病理反應(yīng)［1］。因此，能量代謝障礙是腦缺血損傷的基礎(chǔ)。筆者前期的研究提示，針刺“百會”、“水溝”可顯著改善缺血腦區(qū)的能量代謝［2］。因此，本實驗通過觀察針刺對葡萄糖轉(zhuǎn)運相關(guān)因子GLUT1和GLUT3表達的影響，探討GLUT1和GLUT3在針刺抗腦缺血損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物分組選用SPF級雌性SD大鼠40只，3月齡，體質(zhì)量200～250g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，許可證號：SCXK（浙）20030001。動物飼養(yǎng)于溫度（20～25℃）和濕度（45％～55％）相對較為恒定的IVC獨立大鼠籠具內(nèi)，。每籠4只，動物可以自由攝食和飲水。隨機數(shù)字表法分為4組，正常組、模型組、穴位組、非穴位組，每組各10只。

1.2 急性腦缺血模型制作參照Bederson和薛靜等方法，采用微創(chuàng)開顱法電凝大腦中動脈，制作大鼠急性腦缺血模型［3-4］。大鼠稱體質(zhì)量，按0.40mL/100 g取10％水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位固定，于右側(cè)耳和眼球連線的前1/3和后2/3交界處切開皮膚約1.5 cm切口，剔除組織，暴露顴骨和顳骨，用牙科鉆在顳骨處鉆一深約2mm的小孔，勿傷及大腦皮層，用止血鉗和彎鑷慢慢剝離顳骨骨片，暴露腦膜，尋找大腦中動脈（MCA），充分暴露后，用單極電凝器凝斷MCA，檢查斷端，用消毒棉球填充，縫合皮膚。按照Bederson［3］神經(jīng)缺損體征評分標準對大鼠進行評分，≥1級視為造模成功。

1.3 治療方法參照《實驗針灸學(xué)》［5］，百會取穴在頂骨正中，用30號0.5寸華佗牌毫針向前沿皮刺0.5～1.0 cm，水溝取穴在唇裂正中、鼻尖下1mm處，相同毫針自穴位處向鼻中隔方向斜刺0.2～0.3 cm。采用瀉法，左手持水溝、右手持百會針柄，以120次/min左右進行捻轉(zhuǎn)瀉法，每5分鐘1次，每次1min，留針30min。非穴位組分別在百會、水溝左側(cè)旁開約5mm處進針，避開穴位，手法同穴位針刺。穴位組及非穴位組在24 h再針刺1次，針刺操作由同一人完成。正常組與模型組正常喂養(yǎng)，不予針刺。

1.4 標本采集及檢測動物麻醉并迅速開胸，暴露心臟，用眼科剪剪破心尖部，用灌胃針頭經(jīng)左心室穿刺至主動脈，用止血鉗將灌胃針固定，同時剪開右心耳，慢速流水沖洗。打開滴管，先以生理鹽水（4℃）250mL快速沖管，以清除血液，再灌注4％多聚甲醛溶液（4℃）500mL，先以150mL快速灌注，再以350mL緩慢滴注。灌注完成后，迅速斷頭取腦，小心去除腦膜，修塊后入4％多聚甲醛溶液固定過夜，24 h內(nèi)包埋。取視交叉前1 mm及視交叉后6mm進行切片，每片6μm，用多聚賴氨酸固定于載玻片上。參照George Paxinos大鼠腦立體定向圖譜選取缺血所在區(qū)域，HE染色確定觀察部位［6］。采用Axiovert40CFL顯微鏡和HPIAS-2000彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行圖象采集和分析，測量大腦顳葉皮質(zhì)免疫陽性反應(yīng)物的平均光密度值（MOD），每張切片的每個部位測3個視野，100倍鏡下檢測各片的OD值，分別測定，累加取均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用方差齊性檢驗和單因素方差分析，兩兩均數(shù)比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 針刺對各組大鼠缺血皮質(zhì)GLUT1表達的影響見表1。其余3組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)域GLUT1免疫陽性物MOD值明顯高于正常組（P＜0.05）。穴位組與模型組比較，陽性表達明顯增加（P＜0.05）。穴位組GLUT1陽性表達較非穴位組明顯增加（P＜0.05），而非穴位組與模型組比較無顯著差異（P＞0.05）。上述結(jié)果表明，缺血后GLUT1陽性表達增加；穴位針刺可以明顯增強大腦皮質(zhì)GLUT1陽性表達，而非穴位組表達略有增加，但無顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠缺血皮質(zhì)GLUT1表達比較（±s）

表1 各組大鼠缺血皮質(zhì)GLUT1表達比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與穴位組比較，▲P＜0.05。下同。

組別n MOD值正常組10模型組10穴位組10 0.217±0.037 0.303±0.057* 0.406±0.081*△非穴位組10 0.318±0.063*▲

2.2 針刺對各組大鼠缺血組織皮質(zhì)GLUT3表達的影響見表2。其余3組大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)域GLUT3免疫陽性物MOD值明顯高于正常組（P＜0.05）。穴位組較模型組比較，陽性表達明顯增加（P＜0.05）。穴位組GLUT3陽性表達較非穴位組明顯增加（P＜0.05）；非穴位組與模型組比較無顯著性差異（P＞0.05）。上述結(jié)果表明，缺血后GLUT3陽性表達增加；穴位針刺可以明顯增強大腦皮質(zhì)GLUT3陽性表達，而非穴位組表達略有增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠缺血皮質(zhì)GLUT3表達比較（±s）

表2 各組大鼠缺血皮質(zhì)GLUT3表達比較（±s）

組別n MOD值正常組10模型組10穴位組10 0.307±0.071 0.415±0.090* 0.570±0.104*△非穴位組10 0.468±0.091*▲

3 討論

缺血缺氧腦組織的能量供應(yīng)主要依賴葡萄糖的無氧糖酵解，而葡萄糖的攝取是無氧糖酵解的限速步驟，在缺氧缺血條件下，神經(jīng)元能否從細胞外獲得足夠的葡萄糖是神經(jīng)元獲得缺氧缺血耐受性的關(guān)鍵［7］。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白是細胞攝取葡萄糖、穿過血液-組織屏障的最基本的載體，負責(zé)神經(jīng)元的葡萄糖轉(zhuǎn)運［8］。腦內(nèi)能量代謝的特點使得腦組織對循環(huán)中葡萄糖的持續(xù)供給具有依賴性，因此，GLUT1基因和GLUT3基因在腦組織能量代謝過程中的作用顯得尤突出［9］。腦缺血后，缺血、缺氧狀態(tài)總是與缺乏能量相關(guān)，大腦對缺血、缺氧最敏感，在缺氧缺血的情況下，腦內(nèi)能量代謝由有氧氧化轉(zhuǎn)為無氧酵解，需要消耗大量的葡萄糖，除了能量代謝方式發(fā)生改變外，細胞還出現(xiàn)許多適應(yīng)性變化，如增加線粒體利用氧的能力、酶活性的改變，降低代謝等等［10-11］。GLUT1和GLUT3的合成增加即為適應(yīng)這種變化，是機體出于自身生存需要的一種反應(yīng)［12］，這既可認為是一種急性防御反應(yīng)，又反映腦缺血缺氧后葡萄糖利用需求增加，GLUT1表達的增加使葡萄糖的攝取能力增強，加快葡萄糖的轉(zhuǎn)運，有利于葡萄糖從血液經(jīng)血腦屏障轉(zhuǎn)運入腦組織，使而葡萄糖氧化生成的ATP水平提高，滿足能量代謝的需要，抑制細胞凋亡，延遲能量衰竭引起的級聯(lián)反應(yīng)［13］。GLUT3表達的增加則有利于葡萄糖自腦間隙轉(zhuǎn)運入神經(jīng)元，增強葡萄糖攝取，改善能量代謝，是細胞的保護性反應(yīng)［14］。

目前，針刺療法作為一種非藥物療法，已經(jīng)被公認廣泛用于腦血管病恢復(fù)期治療，并且已被越來越普遍地應(yīng)用于缺血性卒中急性期治療，具有肯定的療效［15］。筆者在前期的microPET實驗中觀察到［2］，針刺百會、水溝能夠明顯改善急性腦缺血模型大鼠缺血皮質(zhì)區(qū)的葡萄糖代謝，超早期針刺能夠有效恢復(fù)血供。為求證進一步的科學(xué)依據(jù)，筆者采用免疫組織化學(xué)法探索針刺改善缺血區(qū)葡萄糖代謝的可能機制。本研究結(jié)果表明，超早期針刺可以有效調(diào)節(jié)腦缺血大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)域GLUT1、GLUT3的表達，改善能量代謝，發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用，進一步為臨床針刺抗腦缺血提供實驗依據(jù)。

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Effect of Ultra Early Acupuncture on Baihui（DU20），Shuigou（DU26）in GLUT1 and GLUT3 of Rats with Acute Cerebral Ischem ia

HUANGWei1，2，JIANG Gong-dao1，2，LIJia1，et al.1 Hubei University of Chi-

nese Medicine，Hubei，Wuhan 430000，China；2 Hubei Provincial Hospital of TCM，Hubei，Wuhan 430061，China

Objective：To study on themechanism of anti cerebral ischemia acupuncture from the earlymicro-PET observation and the very early stage of cerebral ischemia acupuncture which improved glucosemetabolism. Methods：Themodel of acute cerebral ischemia in ratsmade by minimally invasive craniotomy electrocoagulationthe were random ly divided into 4 groups such as the normal group，themodel group，the acupuncture group，the non-acupoint group with 10 rats in each group.Acupoint acupuncture involved Baihui（DU20）and Shuigou（DU26）acupuncture（frequency at 120/min，twirling reinforcing-reducing for 1min and retaining the needle for 30min）.Non-acupoint acupuncture needle were Baihui（DU20）and Shuigou（DU26）respectively in its left side about 5 mm，avoiding the acupoints.The needle way was the same with acupoint acupuncture.Expressions including GLUT1 and GLUT3 were detected by immunohistochemistry in ischemic cortex.Results：After the success ofmodeling，the count of ischemic cortex area GLUT1 and GLUT3 were decreased obviously in rats after cerebral ischemia，compared with the normal group，there is a significant difference between 2 groups（P＜0.01）. The content of GLUT1 and GLUT3 in acupoint group rats compared with model group and non-acupoint group were increased obviously（P＜0.05）.But non-acupoint group compared with model group，there was no significant difference in the above index（P＞0.05）.Conclusion：Acupuncture can improve the ischemic rat cerebral ischemia cortex area energymetabolism，actagainst cerebral ischemia injury，and further for clinical acupuncture in treating cerebral ischemia provide experimental basis.

Acupuncture；Cerebral ischemia；Energymetabolism；Baihui（DU20）；Shuigou（DU26）

R245.2

A

1004-745X（2014）01-0051-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.024

湖北中醫(yī)藥大學(xué)科研課題（201014）△通信作者

2013-09-04）

·研究報告·