電針任督脈對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響*

穆桂萍 曾瑤池 陳鵬典 羅文舒馬曉明 熊益群 劉心亮 劉文赫

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033）

電針任督脈對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響*

穆桂萍 曾瑤池 陳鵬典 羅文舒△馬曉明 熊益群 劉心亮 劉文赫

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033）

目的探究電針任督脈對(duì)局灶性腦缺血模型大鼠神經(jīng)功能和神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響。方法采用線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，利用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分表（mNSS）觀察治療后大鼠神經(jīng)行為學(xué)變化情況，并采用脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)其大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，以及電針任督脈對(duì)其的影響。結(jié)果大鼠造模后mNSS顯著升高，且大腦皮層TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多；與同時(shí)期模型組比較，電針任督脈組腦缺血再灌注7 d、14 d和28 d其mNSS和TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低。結(jié)論電針任督脈可能通過(guò)抑制腦缺血再灌注后皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡和改善神經(jīng)功能缺損來(lái)改善腦缺血損傷。

電針任脈督脈缺血性中風(fēng)細(xì)胞凋亡神經(jīng)功能缺損

腦缺血再灌注損傷可造成神經(jīng)元壞死，又可誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生凋亡。因此，采取相應(yīng)措施抑制神經(jīng)元凋亡，可阻止腦缺血瀑布損傷的擴(kuò)展，有利于患者神經(jīng)功能的恢復(fù)。前期研究表明，電針任督脈經(jīng)穴可持續(xù)促進(jìn)腦缺血大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化，對(duì)腦缺血后神經(jīng)再生具有顯著的積極效應(yīng)［1-2］?；诖耍狙芯繑M從腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)功能缺損方面入手，進(jìn)一步探討電針任督脈對(duì)腦缺血再灌注損傷的可能保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和分組成年健康雄性清潔級(jí)SD大鼠54只，體質(zhì)量（220±20）g，購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和電針組，每組動(dòng)物又隨機(jī)分為大腦中動(dòng)脈栓塞7 d、14 d和28 d 3個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只。

1.2 模型制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以300mg/kg水合氯醛腹腔麻醉，仰臥位固定，參考Kuge造模法［3］，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA），離斷ECA的分支，在游離出的ECA剪一小口，將制備好的尼龍線插入ECA內(nèi)，通過(guò)CCA分叉處經(jīng)ICA插至大腦前動(dòng)脈，有阻力感時(shí)停止進(jìn)線，一般插入深度平均為

（18.5±0.5）mm。缺血2 h時(shí)輕輕向外抽出尼龍線使其球端回至ECA內(nèi)，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組僅分離右側(cè)CCA并離斷右ECA，不予栓塞。

1.3 電針治療術(shù)后24 h電針組予電針治療，穴位參照大鼠的常用任督脈穴位大椎、百會(huì)、水溝、氣海、關(guān)元和承漿6穴的標(biāo)記方法［4］，針刺后加電，采用華佗牌電針儀（SDZ-Ⅱ型），疏密波刺激（疏波30 Hz，密波100Hz），以身體相應(yīng)部位出現(xiàn)輕微顫動(dòng)為準(zhǔn)。持續(xù)時(shí)間為20min，每日1次至動(dòng)物處死。假手術(shù)組和模型組于手術(shù)24 h后將其同電針組大鼠固定于針刺操作臺(tái)上20min，不作任何治療。分別在電針7、14、28 d后處死大鼠。

1.4 觀察內(nèi)容及療效評(píng)價(jià)

1.4.1 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分于術(shù)后7、14、28 d采用雙盲法依據(jù)神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分表mNSS評(píng)分表［5］從肌力、肌張力、意識(shí)、共濟(jì)運(yùn)動(dòng)、反射等方面綜合評(píng)價(jià)大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能。mNSS總分為18分，評(píng)分越高表明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

1.4.2 TUNEL細(xì)胞凋亡各組實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)將動(dòng)物麻醉，經(jīng)左心室插管快速灌注生理鹽水進(jìn)行心臟灌洗，用4％多聚甲醛灌洗固定，迅速斷頭取腦，4％多聚甲醛后固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片。切片常規(guī)脫蠟入水，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，DAB顯色10min，水洗，甲基綠復(fù)染，水洗，脫水，透明，封片。光鏡下觀察凋亡細(xì)胞核被染成棕黃色。凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)方法：選取腦皮層部位，200倍光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，求其陽(yáng)性區(qū)百分比平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。假手術(shù)組大鼠沒(méi)有神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，評(píng)分均為0分。模型組和電針組均出現(xiàn)了不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，且其神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分隨時(shí)間推移而逐漸降低。在缺血再灌注后7 d、14 d和28 d，電針組神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分均小于模型組（P＜0.01）。

表1 各組大鼠再灌注時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)缺損程度評(píng)分比較（±s）

表1 各組大鼠再灌注時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)缺損程度評(píng)分比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.01。

組別n 7 d 14 d 28 d假手術(shù)組6模型組6 0 0 0 10.00±0.63 8.17±0.75 6.17±0.75電針組6 7.67±0.52*5.33±0.52*4.83±0.41*

2.2 各組大鼠大腦皮層神經(jīng)元凋亡TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較見(jiàn)表2。假手術(shù)組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)偶見(jiàn)有凋亡神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠7 d、14 d和 28 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，電針組大鼠7 d、14 d和28 d 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少（P＜0.01）。

表2 各組大鼠再灌注時(shí)間點(diǎn)大腦皮層神經(jīng)元凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠再灌注時(shí)間點(diǎn)大腦皮層神經(jīng)元凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01。

組別n 7 d 14 d 28 d假手術(shù)組6模型組6 1.14±0.20 1.12±0.19 1.11±0.22 7.34±0.22*6.25±0.14*2.76±0.22*電針組6 5.24±0.15△4.14±0.13△2.04±0.13△

3 討論

有研究表明，腦組織缺血早期缺血區(qū)以神經(jīng)元壞死為主，而后期缺血半暗帶發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元死亡則以細(xì)胞凋亡為主，故有效抑制缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡是腦缺血治療的關(guān)鍵［6］。細(xì)胞凋亡是有核細(xì)胞在一定條件下啟動(dòng)其自身內(nèi)部機(jī)制，通過(guò)內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活而發(fā)生的細(xì)胞死亡過(guò)程，主要以細(xì)胞皺縮、胞核凝聚以及DNA鏈在核小體間被活化的核酸內(nèi)切酶切斷、形成180～200 bp等倍體的DNA片段，具有主動(dòng)性、選擇性、可逆性的特點(diǎn)［7］。本研究結(jié)果表明，大鼠腦缺血再灌注損傷后，在缺血側(cè)腦組織可檢測(cè)到較多的凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，這進(jìn)一步證明細(xì)胞凋亡乃腦缺血再灌注損傷中細(xì)胞死亡的途徑之一。

從中醫(yī)學(xué)角度上看，腦缺血針灸治療中，重視督脈和任脈的應(yīng)用，在患者神經(jīng)功能損傷的改善方面具有重要意義［8］。任督二脈均起自胞中。任脈行于身前，為諸陰經(jīng)之海，精血津液皆灌注于內(nèi)，而上通于腦。督脈行身后，循脊入腦，為陽(yáng)脈之海，主周身之陽(yáng)氣，與任脈共同協(xié)調(diào)人體陰陽(yáng)功能。因此歷代醫(yī)家常應(yīng)用督脈和任脈經(jīng)穴治療中風(fēng)因腦脈閉阻、陰陽(yáng)氣血失調(diào)所表現(xiàn)出的神志異常、言語(yǔ)肢體功能障礙等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電針任督脈經(jīng)穴在腦梗死7 d、14 d和28 d時(shí)間點(diǎn)可不同程度地改善其神經(jīng)功能缺損并抑制缺血側(cè)皮層神經(jīng)細(xì)胞的過(guò)度凋亡。筆者推測(cè)，這是否可能與任脈通過(guò)主“妊養(yǎng)”上調(diào)一系列神經(jīng)生長(zhǎng)因子來(lái)保護(hù)神經(jīng)元，以及督脈鼓舞推動(dòng)陽(yáng)氣來(lái)抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)［9］。進(jìn)一步機(jī)制需要在以后的研究工作中闡明。

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E ffects of Conception and Governor Vessel Electro-acupuncture on Neurological Function and Cellular Apoptosis in Cerebral Ischem ia Rats

MU Gui-ping，ZENG Yao-chi，CHEN Peng-dian，et al.Affiliated

Shenzhen Traditional Chinese Medicine Hospital，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangdong，Shenhen 518033，China

Objective：To investigate the effects of conception and governor vessel electro-acupuncture on the neurological function and cellular apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion rats.Methods：The MCAO ratswere prepared with thread embolism method.Following electro-acupuncture intervention，the neurological behavior changeswere observed withmodified neurological severe scores（mNSS），and the cellular apoptosiswas detected with terminal deoxynucleotidyl transferasemediated nick end labeling（TUNEL）method.Results：Aftermodeling establishment，the mNSS and the number of TUNEL-positive cells were apparently increased.Compared with hose in the MCAO group at the same time-points，the mNSS and the number of TUNEL-positive cells in the electro-acupuncture group were apparently decreased.Conclusion：Electro-acupuncture at conception and governor vesselsmay protect the cerebral ischemia-reperfusion injuries via inhibiting cellular apoptosis at the cerebral cortex and improving the neurological functions.

Electro-acupuncture；Conception and governor vessels；Ischemic cerebrovascular disease；Cellular apoptosis；Neurologic impairment

R245.9+7

A

1004-745X（2014）01-0048-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.022

廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201203149）

△通信作者

2013-09-01）

·臨床觀察·