頭針對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織Ang-1 mRNA的影響*

楊 敏 陳邦國 梁 超 張曉明

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065）

頭針對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織Ang-1 mRNA的影響*

楊 敏 陳邦國 梁 超 張曉明

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430065）

目的觀察頭針治療對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織內(nèi)血管生成素（Ang）-1 mRNA表達(dá)的影響，探討其變化規(guī)律并分析腦缺血后Ang-1在缺血性腦卒中發(fā)病中的作用機(jī)制。方法大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組和治療組，治療組又分為缺血再灌注后6、24、48、96 h組，采用改良線栓法制作永久性大腦中動(dòng)脈閉塞模型，RT-PCR技術(shù)檢測(cè)各組大鼠腦組織缺血半影區(qū)內(nèi)Ang-1 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果正常對(duì)照組、假手術(shù)組Ang-1 mRNA中等量表達(dá)，與模型組比較，頭皮針組各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織Ang-1 mRNA含量增多，其中腦缺血再灌注48 h Ang-1 mRNA含量達(dá)高峰，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05或0.01）。結(jié)論Ang-1可能在局灶性腦缺血后與其他血管特異性生長因子共同參與缺血半影區(qū)的新血管形成，有利于缺血半影區(qū)腦組織功能恢復(fù)。

局灶性腦缺血再灌注血管生成素-1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

腦缺血后，血管新生是腦微循環(huán)修復(fù)重建的重要病理生理過程。血管新生程度對(duì)卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)有非常重要的作用，而血管特異性生長因子在生產(chǎn)新的血管過程中起著尤為重要的作用。Ang是一族分泌型的生長因子，是一族特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，最近的研究發(fā)現(xiàn)血管生成素-1（Ang-1）可以減輕腦缺血后血腦屏障的滲漏、減小梗死體積［1］。本研究通過觀察大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦組織Ang-1的表達(dá)，觀察頭針對(duì)血管新生的影響，進(jìn)一步為頭針治療缺血性腦卒中提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組健康成年SD雄性大鼠100只（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)），體質(zhì)量（200±20）g。隨機(jī)分為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組和治療組，模型組和治療組又分為缺血再灌注后6、24、48、96 h組，每組10只。大鼠術(shù)前禁食不禁水。

1.2 模型制備大鼠大腦中動(dòng)脈梗死（MCAO）模型參照Nagasawa、Zea Longa等報(bào)道的方法［2-3］并加以改進(jìn)。參照Zea Longa的5級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［3］對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)分。0級(jí)為無神經(jīng)功能喪失；1級(jí)為左前肢不能充分伸展；2級(jí)為向左環(huán)行運(yùn)動(dòng)，輕度局灶神經(jīng)功能喪失；3級(jí)為向左側(cè)倒，中度局灶神經(jīng)功能喪失；4級(jí)為不能自然行走，重度局灶神經(jīng)功能喪失，只有神經(jīng)功能障礙在1級(jí)以上的大鼠才能保留下來。假手術(shù)組大鼠暴露頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈后即縫合，其余處理同手術(shù)組。正常對(duì)照組大鼠不予處理，正常給水給食。

1.3 頭針方法治療組予頭針治療，選穴依據(jù)《頭針國際標(biāo)準(zhǔn)化方案》，選取頂顳后斜線，頂顳前斜線。大鼠穴位定位根據(jù)華氏等介紹的大鼠穴位圖譜，模擬人體經(jīng)穴定位［4］。頂顳后斜線為百會(huì)至曲鬢（百會(huì)穴在頂骨正中點(diǎn)，曲鬢穴為耳緣直上與耳尖水平線的交點(diǎn)）；頂顳前斜線為頂顳后斜線向前平移0.1寸。用28號(hào)1寸華佗牌不銹鋼針，與頭皮呈30°夾角透刺0.5～0.8寸，快速捻轉(zhuǎn)至針下沉澀感后，接韓氏治療儀，采用疏密波，頻率2Hz/100Hz，強(qiáng)度2mA，每次30min，每日1次。

1.4 標(biāo)本采集與檢測(cè)治療組動(dòng)物按分組情況至規(guī)定時(shí)間后，以10％水合氯醛足量麻醉，斷頭取腦，迅速在冰盤上剝離腦膜，除去嗅球、延髓和小腦，分離右側(cè)大腦皮層，仔細(xì)切取缺血灶區(qū)域大腦皮層組織塊，模型組取與治療組對(duì)應(yīng)區(qū)域腦組織，放入凍存管液氮中保存。正常對(duì)照組及假手術(shù)組在缺血組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)斷頭取腦，其余操作與治療組相同。采用RT-PCR檢測(cè)Ang-1 mRNA表達(dá)水平。Ang-1：F：5′-AGAGGCAGTA CATGCTAAGAATT-3′。R：5′-TCCATGGTTTTGTCCCGCAG-3′。β-actin：F：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCA CCA-3′；R：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。應(yīng)用UVP計(jì)算機(jī)圖像掃描分析系統(tǒng)測(cè)定所檢測(cè)基因表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參照，計(jì)算所檢測(cè)基因的相對(duì)含量。

1.5 各組神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分參照文獻(xiàn)［5］制定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)間灰度值比較采用方差分析，組間相對(duì)灰度值比較采用Dunett T檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評(píng)分的比較見表1。正常對(duì)照組、假手術(shù)組與模型組、頭針組在各時(shí)相上比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；模型組動(dòng)物神經(jīng)缺損癥狀隨著時(shí)間延長逐漸減輕，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；頭針組與模型在各時(shí)相上的NSS比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），以腦缺血再灌注24 h時(shí)較為明顯。

表1 各組大鼠腦缺血后神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分比較（分，±s）

表1 各組大鼠腦缺血后神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分比較（分，±s）

與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組別n 6 h 24 h 48 h 96 h正常對(duì)照組10假手術(shù)組10模型組10 0 0 0 0 0 0 0 0 2.10±0.55 2.30±0.67 2.10±0.57 2.03±0.47治療組10 2.02±0.26 1.92±0.57**1.70±0.48**1.30±0.48**

2.2 Ang-1 mRNA的表達(dá)水平見圖1，表2。正常對(duì)照組、假手術(shù)組缺血半影區(qū)相對(duì)應(yīng)區(qū)域的Ang-1mRNA呈中等水平表達(dá)，兩組相對(duì)灰度值相近（P＞0.05）；模型組中，缺血半影區(qū)內(nèi)Ang-1mRNA表達(dá)水平在腦缺血再灌注后各時(shí)間點(diǎn)均低于治療組（P＜0.01），在腦缺血48 h，治療組Ang-1mRNA表達(dá)水平達(dá)到峰值。

圖1 RT-PCR檢測(cè)Ang-1mRNA表達(dá)水平的電泳圖

表2 各組大鼠缺血區(qū)腦組織Ang-1mRNA表達(dá)的比較（±s）

表2 各組大鼠缺血區(qū)腦組織Ang-1mRNA表達(dá)的比較（±s）

組別n 6 h 24 h 48 h 96 h正常對(duì)照組10假手術(shù)組10模型組10 0.88±0.03 0.88±0.03 0.88±0.03 0.88±0.03 0.87±0.05 0.87±0.05 0.87±0.05 0.87±0.05 0.60±0.03 0.86±0.04 1.23±0.16 0.89±0.05治療組10 0.89±0.04 1.52±0.57**1.70±0.48**1.30±0.48**

3 討論

血管生成是從已有血管發(fā)芽生成新血管的過程。這一過程與血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖相關(guān)，主要包括激活期血管基底膜降解，血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移，重建形成新的血管和血管網(wǎng)，是一個(gè)涉及多種細(xì)胞的多種分子的復(fù)雜過程。血管形成是促血管形成因子和抑制因子協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜過程，正常情況下二者處于平衡狀態(tài)，一旦此平衡打破就會(huì)激活血管系統(tǒng)，使血管生成過度或抑制血管系統(tǒng)使血管退化。Ang是一族分泌型的生長因子，該家族主要由Ang-1、Ang-2、Ang-3和Ang-4 4種因子組成。有研究發(fā)現(xiàn)其在血管內(nèi)皮凋亡、血管形成后期的成熟、穩(wěn)定性及重建方面扮演著非常重要的角色［6］。

頭針，又稱頭皮針，是在頭部特定的穴線進(jìn)行針刺來防治疾病的一種方法，是腦源性疾病的常用針刺方法。《靈樞·大惑論》說“五臟六腑之精氣，皆上注于目而為精……而與脈并為系，上屬于腦，后出于項(xiàng)中”；《靈樞·邪氣臟腑病形》中說“十二經(jīng)脈，三百六十五絡(luò)，其血?dú)饨陨献呖崭[”；《素問·脈要精微論》說“頭者精明之

本研究表明，正常對(duì)照組、假手術(shù)組缺血半暗區(qū)Ang-1mRNA呈中等水平表達(dá)，兩組相對(duì)灰度值相近；而治療組各時(shí)間點(diǎn)均較模型組高，尤其是在腦缺血48 h，治療組Ang-1mRNA表達(dá)水平達(dá)到峰值。由此推斷，頭針治療可提高Ang-1的表達(dá)水平，促進(jìn)與Tie-2的Fc段結(jié)合，使受體磷酸化被激活，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞出芽，形成血管樹樣結(jié)構(gòu)，并募集內(nèi)皮周圍支持細(xì)胞，促進(jìn)血管重塑和成熟，形成完整的血管壁，并通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的相互作用維持血管管腔的完整性和穩(wěn)定性。

綜上所述，頭針通過在一定范圍內(nèi)增加大鼠局灶性腦缺血再灌注后Ang-1的表達(dá)，從而促進(jìn)缺血區(qū)血管新生，減輕腦缺血后的損失，達(dá)到治療缺血性卒中的目的。參考文獻(xiàn)

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Expressions of Angiogenin-1 m RNA after Scalp Acupuncture in Focal Cerebral Ischem ia in Rats Brain Tissues

YANGMin，CHEN Bang-guo，Liang Chao，et al.Hubei University of Chinese Medicine，Hubei，Wuhan

430065，China

Objective:To observe the scalp acupuncture in treatment of cerebral blood vessel generation reperusion of rats with focal cerebral ischemia in the expression changes of different time points and to explore the changing rules and analysis the action mechanism of Ang-1 after cerebral ischemia in cerebral arterial thrombois.Methods:Rats were randomly divided into the normal control group，the control group，the model group and he treatment group.The treatment group was divided into the ischemia reperfusion group at 6，24，48 and 96 h，with the improved wire plug do legal permanentmiddle cerebral artery occlusion（MCAO）model.And then，some ndicators were used RT-PCR to detect each group rats ischemic penumbra area Ang-1 mRNA expression level. Results:In the normal control group，control group of Ang-1 mRNA of the equivalent expression，compared with model group，Ang-1 mRNA of the scalp needle group rats group were increased at each time point.Compared with themodel group，the cerebral ischemia reperfusion 48 h thatwas the highest concentration of these levelswas higher significantly（P＜0.05 or 0.01）.Conclusion:That Ang-1 is imoportant after focal cerebral ischemia and other vascular specific growth factor in ischemic penumbra formation of new blood vessels and inhibit apoptosis of neurons is conducive to improve the ischemic penumbra area blood supply and promote nerve functional recovery.

Focal cerebral ischemia；Reperfusion；Angiopoietin-1；RT-polymerase chain reaction

R285.5

A

1004-745X（2014）01-0012-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.01.006

教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（200805070002）

2013-07-30）