意大利蜜蜂3齡幼蟲胸神經(jīng)節(jié)的結構和發(fā)育

李兆英，王來志，張 虹，陳 云

（1陜西學前師范學院生物科學與技術系，陜西西安 710100；2西安長慶二中，陜西西安 710201）

昆蟲的腹神經(jīng)索（ventral nerve cord）位于消化道腹面，包括頭部的咽下神經(jīng)節(jié)（suboesophageal ganglion，SOG）、胸部（胸神經(jīng)節(jié)thoracic ganglia，TG）和腹部（腹神經(jīng)節(jié)abdominal ganglia，AG）的一系列神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)索。體神經(jīng)節(jié)對應于其相應的體節(jié)，前后兩端以神經(jīng)索與相鄰的神經(jīng)節(jié)相連，有相對的獨立性，成為各體節(jié)的神經(jīng)中樞。胸神經(jīng)節(jié)是足和翅的活動中心，并有一定程度的自主調節(jié)性［1］106－111。

3齡幼蟲是昆蟲胚后發(fā)育過程中的一個重要階段，在這個時期，昆蟲幼蟲的各個組織器官都在快速的生長發(fā)育，細胞的有絲分裂活動旺盛，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)內神經(jīng)細胞的快速分裂增殖，形成了昆蟲幼蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，為后續(xù)蛹以及成蟲神經(jīng)系統(tǒng)的構成打下了結構基礎。關于昆蟲腹神經(jīng)索胚后發(fā)育的特點，國內外的學者進行過一些研究。Tyrer和Gregory［2］對3種蝗蟲Chortoicetes terminifera、Schistocera gregaria和Locus－ta migratoria咽下神經(jīng)節(jié)和胸部的神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)組織學結構進行了比較研究；Prokop和Technau［3］對果蠅Drosophila melanogaster胚后發(fā)育過程中成神經(jīng)細胞的起源進行了研究；Ito等［4］對果蠅胚胎和幼蟲早期腹神經(jīng)索神經(jīng)膠質細胞的類型和發(fā)育進行了觀察。本研究通過形態(tài)解剖、BrdU免疫組織化學（5－bromo－2－deoxyuridine incorporation，BrdU）等技術，對意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica幼蟲發(fā)育中期胸部3個神經(jīng)節(jié)的結構和發(fā)育特點進行了研究，為昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)的結構及發(fā)育特征的研究提供一定的理論證據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

實驗所用的意大利蜜蜂幼蟲、蛹均購自秦嶺灃峪蜜蜂養(yǎng)殖戶，所取材料均來自同一蜂群。幼蟲（larva，L）共5齡（L1-L5），根據(jù)戴氏定律（Dyar＇s law），每一頭幼蟲的齡期通過測量頭殼的寬度來決定；蛹（pupa，P）期約9d（P1-P9）。

1．2 研究方法

1．2．1 組織化學 意大利蜜蜂工蜂的幼蟲和蛹多聚甲醛4℃固定過夜。梯度酒精脫水，二甲苯透明。石蠟包埋，橫向或縱向連續(xù)切片，切片厚度5～7μm，切片裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，烘干備用。切片脫蠟后復水，HE染色，OLYMPUS（BX51）顯微鏡觀察拍照。

1．2．2 BrdU摻入處理 對取得的蜜蜂幼蟲和蛹的活體，從腹部注射約3μL濃度為25mg/mL的BrdU（B9002，Sigma）。

1．2．3 BrdU免疫組織化學染色 將BrdU處理過的1－5齡幼蟲和1-8d蛹各3～5頭，4%多聚甲醛4℃固定8h。70%，80%，90%，95%和100%梯度酒精脫水，石蠟包埋，橫向連續(xù)切片，厚度為7μm。切片裱于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，烘干備用。

切片用二甲苯脫蠟，入梯度酒精復水；抗原修復，PBS洗3次；3%過氧化氫封閉內源性酶10min，TBS洗3次；滴加正常山羊血清封閉液，37℃30min；滴加小鼠BrdU單克隆抗體（1/200）（ab8039，ABCAM），濕盒中4℃孵育過夜，PBS洗3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37℃120min，PBS洗3次；滴加過氧化物酶37℃孵育30min，PBS洗3次；DAB顯色后鏡檢，中性樹膠封片，Nikon數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)（DS－5M）拍照。

陰性對照以PBS代替一抗。

2 結果

意大利蜜蜂在3齡幼蟲階段，胸部具有3個獨立的神經(jīng)節(jié)（圖版：A，B，C）。在每一個神經(jīng)節(jié)的側面和腹面靠近邊緣的位置，能看到大的成神經(jīng)細胞（neuroblast，NB），直徑約1．6±0．3μm，它們通過不對稱的細胞分裂方式形成的神經(jīng)節(jié)母細胞（ganglion mother cells，GMCs）。GMCs排列成串，朝向神經(jīng)纖維網(wǎng)的方向（圖版：D，E）。BrdU標記顯示，在這個時期細胞的分裂活動并不活躍，只在神經(jīng)纖維網(wǎng)周圍以及神經(jīng)節(jié)周圍有少數(shù)的神經(jīng)膠質細胞處于分裂階段（圖版：F，G）；此外，在成神經(jīng)細胞周圍，能看到極少數(shù)的神經(jīng)節(jié)母細胞正在分裂（圖版：G）。到蛹發(fā)育的第5天（P5），胸神經(jīng)節(jié)的發(fā)育基本完成，神經(jīng)纖維網(wǎng)占據(jù)了神經(jīng)節(jié)的大部分，少量的神經(jīng)細胞聚集在它們的周圍（圖版：H）。胸部的第2個神經(jīng)節(jié)（TG2）已由中胸、后胸和腹部的前兩個神經(jīng)節(jié)合并形成，位于中胸與后胸之間（圖版：I）。

3 結論和討論

3．1 不同昆蟲種類神經(jīng)節(jié)的結構和胚后發(fā)育比較

在低等的昆蟲種類，如纓翅目、有翅亞綱較低等類群以及很多完全變態(tài)昆蟲的幼蟲期，其胸腹部可見到11對神經(jīng)節(jié)，即胸部3對，腹部8對。一些進化的類群和很多完全變態(tài)類昆蟲的成蟲，胸、腹部的神經(jīng)節(jié)常有不同程度的合并現(xiàn)象［5］。在意大利蜜蜂的幼蟲發(fā)育階段，胸部和腹部的神經(jīng)節(jié)沒有愈合，共11對，每個神經(jīng)節(jié)在幼蟲早期各自獨立，并且發(fā)育情況相似。但是到了蛹發(fā)育階段，一些神經(jīng)節(jié)逐漸發(fā)生愈合，到蛹發(fā)育的第5天以后，明顯可見7對神經(jīng)節(jié)，其中2對位于胸部，另外5對位于腹部。胸部第1個神經(jīng)節(jié)（TG1）位于前胸，支配胸部第一對足的活動。第2個神經(jīng)節(jié)（TG2）較大，由中胸、后胸和腹部的前兩個神經(jīng)節(jié)合并形成，位于中胸與后胸之間，該神經(jīng)節(jié)發(fā)出的神經(jīng)控制此區(qū)域的足、翅和肌肉等組織器官的活動。家蠶Bom－byx mori胸腹部神經(jīng)節(jié)的愈合也發(fā)生在蛹期，在蛹發(fā)育早期，胸神經(jīng)節(jié)TG1和TG2同腹神經(jīng)節(jié)AG1和AG2融合，腹神經(jīng)節(jié)AG6和AG7/8融合，到蛹發(fā)育的第4天以后融合完成［6］。

圖版 意大利蜜蜂胸部神經(jīng)節(jié)的組織結構和胚后發(fā)育

在昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中，細胞的增殖模式主要有2種：一是大型的成神經(jīng)細胞通過不對稱的細胞分裂方式增殖自己并產(chǎn)生小的神經(jīng)節(jié)母細胞（GMCs）；二是神經(jīng)節(jié)母細胞通過循環(huán)的對稱分裂產(chǎn)生神經(jīng)細胞［7］，這2種細胞增殖方式在意大利蜜蜂腹神經(jīng)索的發(fā)育過程中都能看到。BrdU標記顯示，在意大利蜜蜂3齡幼蟲每一個神經(jīng)節(jié)的側面和腹面靠近邊緣的位置，都能看到大的成神經(jīng)細胞，它們的直徑在1．6±0．3 μm。這些成神經(jīng)細胞通過不對稱的細胞分裂方式形成神經(jīng)節(jié)母細胞，GMCs排列成串，朝向神經(jīng)纖維網(wǎng)的方向。隨后，GMCs經(jīng)過對稱分裂的方式快速增殖，并最終形成神經(jīng)節(jié)中所有的神經(jīng)細胞和神經(jīng)膠質細胞。這樣的神經(jīng)細胞增殖方式在中華蜜蜂腦部神經(jīng)系統(tǒng)的胚后發(fā)育過程中也同樣能夠看到［8］。

就咽下神經(jīng)節(jié)和胸神經(jīng)節(jié)的組織結構和胚后發(fā)育特點來看，它們在幼蟲發(fā)育階段非常相似，幾乎無法區(qū)分，但是胸神經(jīng)節(jié)的增加比率明顯快于咽下神經(jīng)節(jié)［9］。在幼蟲發(fā)育早期時，咽下神經(jīng)節(jié)所占的比例大于胸神經(jīng)節(jié)，其成神經(jīng)細胞的體積（直徑約2．5±0．2μm）［9］也明顯大于胸神經(jīng)節(jié)（直徑約1．6±0．3μm）。但是在變態(tài)發(fā)育時，胸神經(jīng)節(jié)的體積很快超過了咽下神經(jīng)節(jié)，這可能是由于咽下神經(jīng)節(jié)在幼蟲早期就具有生理功能，所以它在孵化時比胸神經(jīng)節(jié)更加成熟的緣故［10］。

3．2 蜜蜂腹神經(jīng)索的神經(jīng)膠質

Ito等［4］通過對果蠅胚胎和幼蟲早期腹神經(jīng)索神經(jīng)膠質細胞的類型和發(fā)育的觀察，將其分為3大類6種類型：（1）表面神經(jīng)膠質（surface－associated glia），包括亞神經(jīng)鞘神經(jīng)膠質（subperineurial glial cells，SPG）和通道神經(jīng)膠質（channel glial cells，CG）；（2）皮層神經(jīng)膠質（cortex－associated glia），包括細胞體神經(jīng)膠質（cell body glial cells，CBG）；（3）神經(jīng)纖維網(wǎng)神經(jīng)膠質（neuropile－associated glia），包括神經(jīng)根神經(jīng)膠質（nerve root glial cells，NG），界面神經(jīng)膠質（interface glial cells，IG）和中線神經(jīng)膠質（midline glial cells，MG）。表面神經(jīng)膠質、皮層神經(jīng)膠質和神經(jīng)纖維網(wǎng)神經(jīng)膠質作為昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)膠質的3大類群，在許多昆蟲中都存在，這已經(jīng)得到證實［9］，但是關于其下類群的分類方法，現(xiàn)在還存在爭議。

對意大利蜜蜂腹神經(jīng)索中神經(jīng)膠質的形態(tài)和位置的觀察表明，3種類型的神經(jīng)膠質在意大利蜜蜂的腹神經(jīng)索中都存在。在意大利蜜蜂3齡幼蟲的腹神經(jīng)節(jié)的邊緣，能夠看到亞神經(jīng)鞘神經(jīng)膠質（SPG），它們的細胞體呈四方形，胞核大而圓，細胞整齊地排列在神經(jīng)節(jié)的周圍；到蛹期，有些細胞變成扁平形。SPGs的細胞質有時會延伸短的突起進入皮層，填充外圍神經(jīng)細胞體之間的空隙。SPGs與神經(jīng)圍膜一起構成昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)與周圍體液之間的物質交換屏障。在果蠅幼蟲的神經(jīng)節(jié)中，SPGs的數(shù)量遠少于蜜蜂，每個神經(jīng)節(jié)中只有16個［4］。

在蜜蜂3齡幼蟲的腹神經(jīng)索中，能夠觀察到皮層神經(jīng)膠質中的細胞體神經(jīng)膠質（CBG）。同果蠅類似，CBGs在皮層中的位置非常顯著，它們的細胞核和細胞體非常不規(guī)則，細胞質延伸突起充滿相鄰的神經(jīng)元細胞體之間的空隙［8］。CBGs主要的作用是為神經(jīng)元細胞體提供營養(yǎng)、支持以及空間約束［11］。

在神經(jīng)纖維網(wǎng)神經(jīng)膠質的3種類型中，我們只觀察到了界面神經(jīng)膠質（IG），它們也被稱為鞘狀神經(jīng)膠質（ensheathing glia）［12］。界面神經(jīng)膠質位于皮層和神經(jīng)纖維網(wǎng)的分界面，其胞核是細長的橢圓體，IGs常發(fā)出突起包圍神經(jīng)纖維網(wǎng)［12］。因為沒有特殊的標記，所以在蜜蜂的腹神經(jīng)索中通道神經(jīng)膠質、神經(jīng)根神經(jīng)膠質（NG）和中線神經(jīng)膠質（MG）無法辨識。

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