趙權(quán)宇,于水燕,張保國,史吉平
(中國科學(xué)院 上海高等研究院,上海 201210)
CO2減排是世界范圍內(nèi)的一個重要課題,微藻可以通過光合作用固定CO2,再將CO2轉(zhuǎn)化成生物質(zhì)。部分微藻在缺氮等脅迫條件下能富集油脂,可以進一步開發(fā)成生物柴油,是非常有潛力的生物燃料[1]。微藻生物煉制的產(chǎn)業(yè)鏈上包括多個技術(shù)難點。其中,藻種選育、大規(guī)模培養(yǎng)和藻水分離等都有了大量研究積累。目前,降低生產(chǎn)成本,提高經(jīng)濟效益仍是微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵,和乙醇發(fā)酵過程耦聯(lián)[2]或聯(lián)產(chǎn)高附加值產(chǎn)品[3]都是可行的模式。
蝦青素是具有超強抗氧化性的脂溶性色素,可以開發(fā)成保健品、藥品或食品添加劑等,市場潛力巨大。紅法夫酵母和雨生紅球藻是主要的蝦青素生產(chǎn)模式體系[4-6]。雖然小球藻中蝦青素的含量低[7-9],但是規(guī)?;囵B(yǎng)小球藻提取油脂后聯(lián)產(chǎn)的蝦青素也有一定規(guī)模。
基元模式是代謝網(wǎng)絡(luò)中從底物到產(chǎn)物的可能途徑或內(nèi)部循環(huán)[10]。通過基元模式分析,可以探討生物代謝調(diào)控機制或進行菌株改造等[11]。本文中筆者首先構(gòu)建小球藻的代謝網(wǎng)絡(luò)模型,通過基元模式分析,考察小球藻在正常培養(yǎng)和缺氮培養(yǎng)條件下油脂代謝和蝦青素的合成。
在文獻構(gòu)建的小球藻代謝網(wǎng)絡(luò)模型基礎(chǔ)上[12-14],增加了蝦青素合成途徑,并完善了三羧酸循環(huán)(TCA)途徑的代謝反應(yīng)。一般來說,代謝網(wǎng)絡(luò)中包含一個生物質(zhì)合成反應(yīng),該反應(yīng)由蛋白質(zhì)、糖、脂類和核酸等組成,以及相關(guān)能量和輔因子代謝計算得到。生物質(zhì)合成反應(yīng)的系數(shù)會隨著培養(yǎng)條件的不同而變化,比如正常培養(yǎng)(+N)和缺氮培養(yǎng)(-N)等[14],這樣計算的基元模式就會不同。為了便于考察小球藻正常培養(yǎng)和缺氮培養(yǎng)的代謝情況,參照文獻[15]的方法,取消了生物質(zhì)合成總反應(yīng),為生物質(zhì)合成反應(yīng)中的若干前體物質(zhì)設(shè)定了相應(yīng)的外部代謝物。構(gòu)建的小球藻代謝網(wǎng)絡(luò)模型包括生化反應(yīng)29個,底物和產(chǎn)物跨膜傳遞以及生物質(zhì)前體生成過程14個,詳見附表。
胞內(nèi)代謝通量分布反映細胞的代謝表型,可以深入了解代謝調(diào)控機制。同位素標(biāo)記代謝通量測定能準確得到胞內(nèi)代謝分布,但是一般集中在中心碳代謝。為了在更大代謝網(wǎng)絡(luò)模型上得到代謝流量分布,可以集成同位素標(biāo)記實驗結(jié)果,通過有約束代謝通量分析獲得代謝通量分布[16-17]。代謝通量可以分解在基元模式上。通過基于基元模式的算法進行胞內(nèi)代謝通量的估算也是可行的。首先由CellNetAnalyzer(V6.0)[18]計算基元模式,見式(1)。
式中:E為基元模式矩陣,λ為基元模式系數(shù),v為代謝通量。筆者前期開發(fā)了基于基元模式的算法,可以集成同位素標(biāo)記實驗數(shù)據(jù),通過最大熵原理估算胞內(nèi)代謝分布[19-20]。具體算法見式(2)~(5)。
通過平均預(yù)測偏差比較預(yù)測值與實驗值的差異,見式(6)。
式中:vexp為實驗值;vestimated為代謝通量的預(yù)測值;ne為實驗測定的代謝通量數(shù)。
筆者定義了基元模式概率pi[19]。第 i條基元模式概率pi由基元模式系數(shù)λi計算得到,反映了每條基元模式對代謝表型的貢獻。
式中:vsubstrateuptake為底物攝取速率;esubstrateuptake,i為基元模式矩陣中第i條基元模式中底物攝取反應(yīng)對應(yīng)的系數(shù)。所有基元模式概率加合后為1。
基元模式的一個作用是分析代謝產(chǎn)物的理論合成效率。一般來說,除了內(nèi)部循環(huán)外,每條基元模式都包括底物攝取和產(chǎn)物合成反應(yīng)。由底物攝取和產(chǎn)物合成的基元模式系數(shù)即可計算該基元模式中的產(chǎn)物合成效率,見式(8)。
式中:Yi,product為第i條基元模式的某產(chǎn)物的合成效率;λi,product formation和 λi,product formation分別為第 i條基元模式中某產(chǎn)物的合成和底物攝取的基元模式系數(shù)。
根據(jù)文獻[13]報道的小球藻代謝通量數(shù)據(jù),由式(2)~式(4)計算基元模式系數(shù),再由式(5)估算胞內(nèi)代謝通量分布,結(jié)果見圖1。利用式(6)計算正常和缺氮培養(yǎng)條件下的代謝通量平均預(yù)測偏差均為0.05,蝦青素的合成通量分別為0.38和0.35。
圖1 小球藻正常培養(yǎng)(+N)和缺氮培養(yǎng)(-N)條件下胞內(nèi)代謝通量估算值與實驗值[13]比較Fig.1 Comparison of estimated flux distributions and experimental data[13] of Chlorella sp under normal condition and nitrogen-limited conditions
由式(7)計算小球藻正常培養(yǎng)和缺氮培養(yǎng)的基元模式概率,結(jié)果見圖2。
圖2 小球藻正常培養(yǎng)和缺氮培養(yǎng)條件下基元模式概率Fig.2 Probabilities of elementary modes of Chlorella sp.under normal and nitrogen limited conditions
由圖2可見:在正常培養(yǎng)和缺氮培養(yǎng)條件下,第603、77、309和61條基元模式對代謝表型的貢獻都是較大的。這4條基元模式在正常培養(yǎng)條件下的基元模式概率分別為26.14%、19.18%、8.84%和6.79%,總貢獻為60.90%;在缺氮培養(yǎng)條件下的貢獻為27.39%、27.88%、11.05%和11.21%,總貢獻為77.53%。
第603條基元模式(EM603)包含糖酵解(EMP)和TCA途徑(圖3(a))。第77條基元模式(EM77)是從葡萄糖到生物質(zhì)中乙酰輔酶A的合成(圖3(b))。乙酰輔酶A是氨基酸和油脂合成的前體化合物。第309條基元模式(EM309)表示的是從葡萄糖到葡萄糖-6-磷酸進入磷酸戊糖途徑,經(jīng)糖酵解產(chǎn)生丙酮酸再進入TCA途徑(圖3(c))。第61條基元模式(EM61)是從葡萄糖經(jīng)磷酸戊糖途徑和糖酵解到生物質(zhì)中乙酰輔酶A的合成(圖3(d))。
這4條基元模式都包含能量代謝反應(yīng),說明能量代謝對小球藻代謝表型有重要作用。缺氮條件下,包含乙酰輔酶 A合成的基元模式(EM77和EM61)的貢獻顯著增加,對應(yīng)的代謝表型表現(xiàn)為油脂含量的增加。概率最大的4條基元模式中并不包含蝦青素的合成反應(yīng)。在正常和缺氮培養(yǎng)條件下,含有蝦青素合成的基元模式概率(pi),最大基元模式如圖4所示。由圖4可知:該途徑不包含其他生物質(zhì)前體的合成,這也是合成蝦青素效率最高的途徑。EMP途徑有蝦青素合成的2個重要前體,而從琥珀酸到富馬酸的反應(yīng)包含F(xiàn)AD等輔酶,這些輔酶也參與到蝦青素的合成,因此這條基元模式包含了TCA途徑。
由式(8)計算乙酰輔酶A流向生物質(zhì)合成(附表中反應(yīng)R30)或蝦青素合成(附表中反應(yīng)R40)的理論產(chǎn)率。小球藻在正常和缺氮培養(yǎng)條件下的實際產(chǎn)率也標(biāo)注在圖5中。油脂產(chǎn)率和蝦青素產(chǎn)率是競爭關(guān)系。由圖4可知:在丙酮酸(PYR)節(jié)點,如果向蝦青素的代謝通量增加,則向乙酰輔酶A的通量將減少,直接影響油脂產(chǎn)率。由圖5可知,小球藻蝦青素的最大理論產(chǎn)率為11.27%。氮脅迫(-N)使得油脂產(chǎn)率提高,但是蝦青素含量也略有降低。如果要達到油脂和蝦青素合成的最大化,還有很大的優(yōu)化空間。很多手段可以調(diào)控蝦青素的合成,異養(yǎng)即使無光也可以合成蝦青素[9]。營養(yǎng)、鹽度、鐵離子、光照和活性氧等也會調(diào)控蝦青素的累積[7-9,21-22],蝦青素合成和油脂積累的協(xié)調(diào)優(yōu)化還有待研究。
圖3 小球藻正常和缺氮培養(yǎng)條件下主要基元模式:EM603(a)、EM77(b)、EM309(c)和EM61(d)Fig.3 Dominant elementary modes of Chlorella sp.under normal and nitrogen limited conditions:EM603(a),EM77(b),EM309(c)and EM61(d)
1)建立了包含蝦青素合成途徑的小球藻代謝網(wǎng)絡(luò)模型,并計算了其基元模式;集成同位素標(biāo)記代謝通量數(shù)據(jù),估算了胞內(nèi)代謝通量分布。正常培養(yǎng)和缺氮培養(yǎng)下蝦青素的代謝通量分別為0.38和0.35。
2)應(yīng)用最大熵算法求取了正常和缺氮培養(yǎng)條件下小球藻的基元模式概率。在這2種培養(yǎng)條件下,4條基元模式對代謝表型的貢獻分別為60.95%和77.53%。蝦青素的最大理論產(chǎn)率為11.27%,而2種培養(yǎng)條件下的實際產(chǎn)量均低于0.4%。
圖4 蝦青素的最有效基元模式ig.4 Most efficient elementary mode for astaxanthin production
圖5 小球藻蝦青素產(chǎn)率與生物質(zhì)中乙酰輔酶A產(chǎn)率的關(guān)系Fig.5 Relations between astaxanthin yield and ACCOA yield in biomass
附表:小球藻代謝網(wǎng)絡(luò)模型(EXT:外部代謝物;==>不可逆反應(yīng);<==>可逆反應(yīng))
R15:ACCOA+ICIT+NAD==>NADH+FUM+MAL R16:MAL+NADP==>CO2+NADPH+PYR R17:PEP+CO2==>OAA R18:OAA+ATP==>ADP+PEP+CO2 R19:G6P+NADP==>D6PGL+NADPH R20:D6PGL+NADP==>P5P+CO2+NADPH R21:P5P+E4P<==>F6P+GAP R22:2 P5P<==>S7P+GAP R23:S7P+GAP<==>F6P+E4P R24:GAP+ATP+NADPH+PYR==>ADP+IPP+NADP+CO2 R25:NADH+8 IPP+FADH2==>Astaxanthin+NAD+FAD R26:NAD+NADPH==>NADH+NADP R27:1.5 ADP+FADH2+0.5 O2==>1.5 ATP+FAD R28:ATP==>ADP R29:ADP+NADH+0.5 O2==>NAD+ATP R30:ACCOA==>ACCOAEXT R31:AKG==>AKGEXT R32:E4P==>E4PEXT R33:G6P==>G6PEXT R34:GAP==>GAPEXT R35:OAA==>OAAEXT R36:3PG==>3PGEXT R37:P5P==>P5PEXT R38:PEP==>PEPEXT R39:PYR==>PYREXT R40:Astaxanthin==>AstaxanthinEXT R41:GLCEXT==>GLC R42:O2<==>O2EXT R43:CO2<==>CO2EXT
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