小干擾RNA長(zhǎng)期作用乙型肝炎病毒轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響

張衛(wèi)云，石玉玲，孫朝暉，任廣立，張蓉 ，唐榮芝

廣州軍區(qū) 廣州總醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科；b.兒科；廣東 廣州 510010

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染過(guò)乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），其中約4億人為慢性感染者，每年有超過(guò)100萬(wàn)人死于HBV感染相關(guān)疾病。中國(guó)是HBV感染的高發(fā)地區(qū)，乙肝表面抗原攜帶者占全國(guó)人口的10%～15%。目前，針對(duì)慢性乙肝的抗病毒治療主要采用重組干擾素和以拉米夫定和阿德福韋為代表的核苷類似物，但迄今其治療效果不能讓人滿意，并伴有嚴(yán)重的副作用，停藥后的反彈和耐藥株的出現(xiàn)仍然是亟待解決的難題。自RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，作為基因治療手段之一的RNAi已被證實(shí)是非常有開發(fā)前景的HBV治療手段之一[1-2]。RNAi是保守的進(jìn)化機(jī)制，有利于對(duì)抗外來(lái)基因的入侵如病毒和轉(zhuǎn)座子等，是基因水平的抗病毒免疫機(jī)制。而小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）似乎對(duì)已存在的HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed cir?cular DNA，cccDNA）沒有作用，徹底清除HBV尚有一定的困難。因此，從增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答的角度，探討siRNA長(zhǎng)期作用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠的機(jī)體免疫應(yīng)答狀況是非常必要的。

1 材料和方法

1.1 材料

HBV全基因轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)自解放軍第458醫(yī)院全軍傳染病中心；正常BALB/c小鼠來(lái)自我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，于實(shí)驗(yàn)室相對(duì)清潔環(huán)境飼養(yǎng)，體重（20±2）g，8～10周齡，雌雄分籠，穩(wěn)定2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)立特異性siRNA組（pSilencer4.1/C2）、PBS對(duì)照組和正常BALB/c小鼠組，每組10只小鼠。

根據(jù)既往研究[3-5]，選擇pSilencer4.1/C2載體（本單位構(gòu)建并保存）轉(zhuǎn)染HBV轉(zhuǎn)基因小鼠。

免疫球蛋白檢測(cè)采用德國(guó)SIEMENS公司生產(chǎn)的BNⅡ特種蛋白分析儀及配套試劑；細(xì)胞因子試劑盒由上海研吉生化科技有限公司提供，采用芬蘭Denley Drogon公司的Wellscan mk2酶標(biāo)儀分析；CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞檢測(cè)采用美國(guó)BD公司生產(chǎn)的BD FACS Calibur流式分析儀及配套試劑。

1.2 方法

參照文獻(xiàn)[6-7]，用高壓水尾靜脈注射法將siRNA表達(dá)載體按5 mg/kg給藥，按小鼠體重的8%注入，均以 PBS（1.5～2.0 mL）稀釋，10 s左右完成注射。注射后1、3、6、9和12個(gè)月通過(guò)小鼠內(nèi)眥靜脈采血，采用免疫散射比濁法測(cè)定小鼠血清中的IgG、IgA和IgM，ELISA法測(cè)定IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用t檢驗(yàn)做差異的顯著性分析，以P＜0.05為差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長(zhǎng)期siRNA治療后轉(zhuǎn)基因小鼠IgG、IgA和IgM水平的變化

用散射免疫比濁法檢測(cè)了3組小鼠的IgG、IgA和IgM水平。從圖1可以看出，隨著siRNA作用時(shí)間的延長(zhǎng)，pSilencer4.1-C2組小鼠IgG、IgA、IgM的表達(dá)水平均顯著增加，至第9個(gè)月時(shí)幾乎接近于正常BALB/c小鼠組水平，與PBS組相比差異顯著（P＜0.05），而PBS組免疫球蛋白水平基本無(wú)改變。

2.2 長(zhǎng)期siRNA治療后轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞因子表達(dá)水平的變化

用ELISA方法檢測(cè)了3組小鼠血清中相關(guān)細(xì)胞因子的水平。隨著siRNA作用時(shí)間的延長(zhǎng)，pSilenc?er4.1-C2組小鼠的IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ的表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)，水平顯著增加，至第12個(gè)月時(shí)幾乎接近于正常BALB/c小鼠組水平，與PBS組相比差異顯著（P＜0.05），而PBS組細(xì)胞因子水平基本無(wú)改變。見圖2。

2.3 長(zhǎng)期siRNA治療后轉(zhuǎn)基因小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的水平變化

為了解細(xì)胞免疫水平的變化，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了小鼠外周血中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的水平，并計(jì)算CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞的比值。pSilenc?er4.1-C2組在特異性siRNA長(zhǎng)期治療下，轉(zhuǎn)基因小鼠CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞水平均有上升趨勢(shì)，與PBS組相比有顯著性差異（P＜0.05），治療后第9個(gè)月，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的水平接近正常BALB/c小鼠組，CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞的比值更接近于正常BALB/c小鼠組，而PBS組基本無(wú)改變。見圖3。

圖1 長(zhǎng)期siRNA治療后不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠血清中IgG（A）、IgA（B）、IgM（C）水平的變化

圖2 長(zhǎng)期siRNA治療后不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠血清中IL-2（A）、IL-4（B）、IL-6（C）、IFN-γ（D）水平的變化

圖3 長(zhǎng)期siRNA治療后不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠外周血CD4+（A）、CD8+（B）T淋巴細(xì)胞水平的變化及CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值（C）

3 討論

通常在機(jī)體免疫狀態(tài)好的情況下，急性HBV感染多容易被清除。但是當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，不能產(chǎn)生有效的針對(duì)HBV的特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞反應(yīng)（CTL），從而不能有效地徹底清除HBV。病毒產(chǎn)生針對(duì)機(jī)體先天免疫的逃逸策略是HBV感染慢性化、持續(xù)化的主要原因之一[8-9]。實(shí)驗(yàn)表明HBV感染可導(dǎo)致機(jī)體先天免疫降低，而特異性siRNA長(zhǎng)期治療后細(xì)胞免疫和體液免疫水平均有上調(diào)，與PBS組相比差別具有顯著意義，而且在特異性siRNA長(zhǎng)期作用下機(jī)體免疫功能接近正常BALB/c小鼠組，HBV轉(zhuǎn)基因小鼠通過(guò)提高血清中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、IgG、IgA、IgM和外周血CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞水平來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫。

免疫球蛋白是具有抗體活性的動(dòng)物蛋白，主要存在于血漿中，也見于其他體液、組織和一些分泌液中，是機(jī)體體液免疫的物質(zhì)基礎(chǔ)。在免疫系統(tǒng)中，免疫球蛋白參與體液免疫應(yīng)答反應(yīng)中的免疫特異性結(jié)合、與補(bǔ)體的結(jié)合及免疫調(diào)節(jié)。我們選用IgG、IgA、IgM進(jìn)行分析，結(jié)果表明，與PBS組相比，pSilenc?er4.1-C2組的3種免疫球蛋白水平均顯著增加，至第9個(gè)月時(shí)幾乎接近于正常BALB/c小鼠水平，差異顯著，說(shuō)明特異性siRNA長(zhǎng)期作用下可提高機(jī)體免疫球蛋白含量，從而增加機(jī)體的體液免疫反應(yīng)。

白細(xì)胞介素是在白細(xì)胞或免疫細(xì)胞間相互作用的淋巴因子，在傳遞信息，激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、增殖與分化，以及炎癥反應(yīng)中起重要作用。IL-2主要由活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生，是具有廣泛生物活性的細(xì)胞因子，對(duì)T細(xì)胞的激活及生長(zhǎng)有作用，是調(diào)控免疫應(yīng)答的重要因子，也參與抗體反應(yīng)、造血和腫瘤監(jiān)視。IL-4是一種多功能細(xì)胞因子，主要由Th2細(xì)胞、肥大細(xì)胞及嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生，具有促進(jìn)B細(xì)胞增殖、分化，誘導(dǎo)IgG1和IgE產(chǎn)生，促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化等作用。IL-6由Th2細(xì)胞分泌，它可誘導(dǎo)B細(xì)胞分化并產(chǎn)生免疫球蛋白，具有促進(jìn)T細(xì)胞增殖生長(zhǎng)、促進(jìn)骨髓造血干細(xì)胞增殖、增強(qiáng)血細(xì)胞分化、抗瘤效應(yīng)等。IFN-γ是一類分泌性蛋白，具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能，是Th1細(xì)胞分泌的特征性細(xì)胞因子，具有促進(jìn)Th1細(xì)胞分化、上調(diào)Th1型免疫反應(yīng)對(duì)病毒抑制與清除的作用。在乙肝病毒的清除過(guò)程中，機(jī)體主要通過(guò)IFN-γ介導(dǎo)非溶細(xì)胞途徑清除病毒［10］。IL-2和IFN-γ由Th1細(xì)胞分泌，通過(guò)促進(jìn)CTL、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活化和增殖，介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)，在抗胞內(nèi)病原體感染中發(fā)揮重要作用。IL-4和IL-6是Th2細(xì)胞分泌，其主要功能在于刺激B細(xì)胞增殖，參與體液免疫。當(dāng)機(jī)體處于正常狀態(tài)時(shí)，Th1/Th2型細(xì)胞因子相互制約，處于動(dòng)態(tài)平衡，維持正常的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，任何一方的增多或減少都會(huì)使正常免疫調(diào)節(jié)失去平衡而引起免疫功能紊亂［11］。

T淋巴細(xì)胞亞群是參與機(jī)體免疫防御的重要細(xì)胞，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞在機(jī)體細(xì)胞免疫中具有非常重要的作用。CD4+T淋巴細(xì)胞具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)活性、輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體、分泌細(xì)胞因子的作用；而CD8+T淋巴細(xì)胞有免疫抑制和細(xì)胞毒性的作用。此2類細(xì)胞所占比例在一定程度上可以揭示機(jī)體的免疫狀態(tài)。在正常情況下，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值應(yīng)在一定范圍內(nèi)并處于一種平衡狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，特異性siRNA長(zhǎng)期作用下可使HBV轉(zhuǎn)基因小鼠機(jī)體細(xì)胞免疫水平上調(diào)，外周血中的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞增加，CD4+/CD8+T細(xì)胞比值升高，表現(xiàn)出一定的正向免疫調(diào)節(jié)作用，有利于機(jī)體抗病毒、抗腫瘤、抵抗宮內(nèi)感染。

總之，慢性HBV感染由于持續(xù)存在的HBV cccDNA，單靠RNAi目前很難徹底清除病毒。因此，利用特異性siRNA長(zhǎng)期作用機(jī)體，探討機(jī)體免疫反應(yīng)，可為以后免疫疫苗提供應(yīng)用時(shí)機(jī)。

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