艾灸預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷模型大鼠大腦皮質(zhì)caspase-3蛋白表達(dá)的影響*

肖愛嬌 康明非 張 毫 龔麗麗

缺血性腦血管病約占全部腦血管病的80%左右[1]，其中大多由大腦中動脈阻塞引起。目前國際上通常采用溶栓療法[2]以恢復(fù)腦組織血流供應(yīng)，但再灌注本身有時也可加重組織的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，即引起腦缺血再灌注損傷。因此，腦缺血再灌注損傷是缺血性腦血管病的重要病理過程。有研究認(rèn)為，細(xì)胞凋亡參與了腦缺血再灌注損傷的發(fā)病過程[3]，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-3在細(xì)胞凋亡中起重要調(diào)控作用，其激活后可引起細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)改變和DNA片段化[4]。研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注后caspase-3的表達(dá)明顯增加[5]。本課題前期預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，艾灸預(yù)處理“大椎”穴能縮小大腦中動脈缺血再灌注損傷模型大鼠的腦梗死面積，減輕腦缺血再灌注損傷。本研究建立大腦中動脈栓塞（mid?dle cerebral artery occlusion,MCAO）缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察艾灸預(yù)處理對大腦皮質(zhì)caspase-3蛋白表達(dá)的影響，以探討艾灸預(yù)處理減輕腦缺血再灌注損傷的機(jī)制，旨在為艾灸治未病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 清潔級雄性SD大鼠21只，體質(zhì)量220～280 g，購自江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心（合格證編號：JZDW2011-0336）。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組（6只）、模型組（8只）和艾灸預(yù)處理組（7只）。模型組：行MCAO手術(shù)，2 h后行再灌注。假手術(shù)組：同模型組，但不插栓線。艾灸預(yù)處理組：艾灸“大椎”穴后行MCAO手術(shù)，2 h后行再灌注。3組術(shù)后均單籠飼養(yǎng)。納入標(biāo)準(zhǔn)：腦缺血再灌注時神經(jīng)功能缺失評分為1～3分且存活≥3 d者。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M死亡2只、艾灸預(yù)處理組死亡1只。

1.2 主要試劑及儀器 caspase-3抗體（美國Cell Signaling technology公司產(chǎn)品），羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔IgG（美國KPL公司產(chǎn)品）；CM 1950衡冷低溫切片機(jī)、Leica 2000顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（德國Leica公司）。

1.3 腦缺血再灌注損傷模型制備 參照文獻(xiàn)[6-7]的頸內(nèi)動脈線栓法并略做改良，即大鼠用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，頸部正中切口，分離左側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，將頸總動脈近心端、頸外動脈用絲線扎緊，頸總動脈遠(yuǎn)心端上打一活結(jié)，頸內(nèi)動脈用微動脈夾夾閉，用眼科剪在頸總動脈上剪一V形小切口，用前端蘸有石蠟的魚線（直徑0.237 mm）插入頸總動脈，此時稍扎緊活結(jié)以減少或避免出血，松開微動脈夾，用鑷子夾緊魚線，沿頸內(nèi)動脈直進(jìn)入大腦中動脈開口處，插入深度從分叉處算起約22 mm，線栓尾端引出皮膚切口，便于拔線。假手術(shù)組同模型組，只是不插栓線。大鼠MCAO 2 h后將栓線向外拔出1 cm左右以進(jìn)行再灌注。術(shù)中和術(shù)后室溫控制在25℃左右。

1.4 艾灸治療方法 將艾灸預(yù)處理組大鼠項(xiàng)部的毛發(fā)剪去，露出“大椎”穴作為艾灸穴位。用直徑0.4 cm、長10 cm的艾條（江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制），距穴位2 cm左右溫和灸大鼠，1次/d，15 min/次，共10 d。

1.5 腦組織梗死檢查 于MCAO造成腦缺血再灌注后3 d，用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后在冰上迅速取腦，將腦置于-20℃冰箱快速冷凍20 min，以2 mm左右間隔自額向枕切成5個冠狀切片，放入1%TTC染液中，置于37℃溫箱中染色20 min，用甲醛溶液進(jìn)行固定后拍照，計算腦梗死體積與全腦體積的百分比。

1.6 腦組織病理檢查 大體觀察腦組織外觀后再行光鏡和電鏡檢查。光鏡檢查：于MCAO造成腦缺血再灌注后3 d，用3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后仰臥位固定，用預(yù)冷的(4℃)4%多聚甲醛溶液進(jìn)行心臟灌注，然后在冰上迅速取腦，分離大腦皮質(zhì)，切取小塊置于甲醛溶液中固定，再經(jīng)石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察大腦皮質(zhì)形態(tài)結(jié)構(gòu)。電鏡檢查：將大鼠腦組織分離大腦皮質(zhì)，切取1 mm3的小塊置于2.5%戊二醛溶液中固定，然后放入1%鋨酸后固定2 h，PBS沖洗2次，經(jīng)各級乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋烘烤，進(jìn)行超薄切片，經(jīng)醋酸鈾、枸椽酸鉛雙重染色等步驟，最后透射電子顯微鏡觀察、照相。

1.7 熒光免疫組織化學(xué)法檢測大腦皮質(zhì)caspase-3蛋白水平 將大鼠腦組織分離大腦皮質(zhì)，切取小塊置于4%多聚甲醛溶液中后固定4～6 h，然后移至梯度蔗糖溶液中脫水。待組織塊下沉后，于-20℃進(jìn)行大腦皮質(zhì)冰凍切片，厚35 μm，于切片保護(hù)液中-20℃保存。每只大鼠取6片，PBS漂洗、正常血清封閉后加入兔抗大鼠caspase-3抗體（1∶400），4℃孵育過夜，陰性對照組不加一抗，用PBS代替。PBS液清洗后，加入羅丹明標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶200），37℃孵育1.5 h。風(fēng)干，熒光封片劑封固，熒光顯微鏡觀察，拍照。細(xì)胞涂片上有caspase-3的部位呈紅色，分別計數(shù)每張圖片的caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 計量指標(biāo)以x±s表示，用SPSS 10.0進(jìn)行分析，3組比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腦組織梗死觀察 大鼠腦缺血再灌注后3 d，假手術(shù)組腦組織全部染成紅色，未見白色梗死灶。模型組左側(cè)半球有白色梗死灶，右側(cè)半球呈紅色。艾灸預(yù)處理組左側(cè)半球有白色梗死灶，但較模型組明顯縮??；右側(cè)半球呈紅色，見圖1。模型組腦組織梗死體積百分比明顯大于假手術(shù)組和艾灸預(yù)處理組(P＜0.05)，見表1。

Table 1 The percentage of infarct size and caspase-3 positive cells after 3 days of reperfusion表1 各組腦組織梗死體積百分比及caspase-3陽性細(xì)胞數(shù) （x±s）

2.2 大鼠腦組織病理觀察 假手術(shù)組：肉眼觀察可見腦組織紅潤，腦溝及腦回清晰。鏡下見大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞排列致密、整齊；細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、邊緣清晰。模型組：肉眼觀察可見左側(cè)腦組織表面蒼白、出現(xiàn)液化，且腦溝變淺、腦回變寬。鏡下見梗死側(cè)大腦皮質(zhì)大量神經(jīng)細(xì)胞變性壞死、萎縮。艾灸預(yù)處理組：肉眼觀察可見左側(cè)半球腦組織表面較蒼白，腦溝及腦回較清晰。鏡下見梗死側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞排列較致密，細(xì)胞損傷較模型組明顯減輕。見圖2。

2.3 電鏡觀察 假手術(shù)組：大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞層厚，密度大，排列整齊、緊密；細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、邊緣清晰。模型組：患側(cè)大腦皮質(zhì)細(xì)胞層變薄，細(xì)胞間隙增大，排列紊亂、疏松；細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，甚至有大量細(xì)胞缺失，核膜不完整，核染色質(zhì)邊聚。艾灸預(yù)處理組：患側(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞層厚，密度大，排列較整齊、緊密；細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、邊緣清晰。見圖3。

2.4 大鼠大腦皮質(zhì)caspase-3陽性細(xì)胞數(shù) 大腦皮質(zhì)中表達(dá)caspase-3蛋白的部位呈現(xiàn)紅色，見圖4。模型組大腦皮質(zhì)caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)多于假手術(shù)組和艾灸預(yù)處理組(P＜0.05)，見表1。

3 討論

自1990年Kitagawa等[8]在沙土鼠腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究中觀察到缺血預(yù)處理的腦保護(hù)作用后，其他學(xué)者又陸續(xù)觀察到采用其他多種預(yù)處理方式如缺氧、低氧、高溫、針刺預(yù)處理等均可以引起機(jī)體對再次嚴(yán)重缺血的耐受。然而相對于西醫(yī)利用短暫的缺血、缺氧、高溫等預(yù)處理方法[9]來說，艾灸預(yù)處理具有創(chuàng)傷小、易于調(diào)控的優(yōu)勢，而且刺激溫和，易于接受。

艾灸預(yù)處理即“逆灸”，屬于逆針灸的一部分，是以“治未病”為主要理論基礎(chǔ)的防病保健方法。它是通過艾灸激發(fā)經(jīng)絡(luò)之氣，提高機(jī)體抗病能力，從而達(dá)到防止疾病的發(fā)生、減輕隨后疾病的損害和保健延年的目的。研究發(fā)現(xiàn)艾灸預(yù)處理具有抗感染、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等作用[10]。近年有研究采用“4-動脈阻斷”方法建立大鼠全腦缺血模型，觀察到艾灸預(yù)處理能有效地誘導(dǎo)腦缺血耐受，具有神經(jīng)保護(hù)作用[11]。然而，關(guān)于艾灸預(yù)處理能否減輕腦缺血再灌注損傷的報道還不多見。本研究結(jié)果顯示艾灸預(yù)處理可縮小腦缺血再灌注損傷模型大鼠的腦梗死面積，減輕腦缺血再灌注損傷。

近年來研究證實(shí)，在腦缺血再灌注引起的腦組織損傷進(jìn)展過程中，有許多相互關(guān)聯(lián)的機(jī)制在起作用，涉及的主要病理生理過程有能量耗竭、離子紊亂、神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)、酸中毒、興奮性毒性、炎癥、血管通透性改變、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等[3]。其中，細(xì)胞凋亡可能在腦缺血性腦損傷的病理過程中起重要作用。研究表明，腦缺血后神經(jīng)元除壞死之外，還存在另一種死亡形式，即細(xì)胞凋亡，腦缺血再灌注可引起腦細(xì)胞凋亡[12]。本研究大腦皮質(zhì)電鏡觀察結(jié)果提示，大鼠腦缺血再灌注后發(fā)生了細(xì)胞凋亡，而艾灸預(yù)處理具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。但具體作用機(jī)制還不十分清楚。

近年來，caspase-3在細(xì)胞凋亡中的作用備受關(guān)注。有研究表明caspase-3在細(xì)胞凋亡中起著重要的調(diào)控作用，被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過程中的主要執(zhí)行者，可水解多種蛋白底物，包括細(xì)胞骨架蛋白、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、DNA修復(fù)調(diào)節(jié)因子以及細(xì)胞存活等環(huán)節(jié)中重要的蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。腦缺血再灌注后大腦皮質(zhì)caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加[5]。本研究結(jié)果提示，艾灸預(yù)處理可能通過降低大腦皮質(zhì)caspase-3蛋白的表達(dá)而達(dá)到減輕腦缺血再灌注損傷。

綜上，大腦中動脈缺血2 h后進(jìn)行再灌注引起的大腦皮質(zhì)caspase-3蛋白表達(dá)增加可能是造成腦缺血再灌注損傷發(fā)生機(jī)制之一，而減少大腦皮質(zhì)caspase-3蛋白表達(dá)則可能是艾灸預(yù)處理“大椎”穴減輕腦缺血再灌注損傷、發(fā)揮腦保護(hù)效果的作用機(jī)制之一。

（圖1~4見插頁）

[1]Durukan A,Tatlisumak T.Acute ischemic stroke:overview of major experimental rodent models,pathophysiology,and therapy of focal cerebral ischemia[J].Pharmacol Biochem Behav,2007,87(1):179-197.

[2]The national institute of neurological disorders and stroke r-tPA stroke study group.Tissue plasminogen activator for acute ischemic stroke[J].N Engl J Med,1995,333(24):1581-1587.

[3]Kao TK,Ou YC,Liao SL,et al.Opioids modulate post-ischemic progression in a rat model of stroke[J].Neurochem Int,2008,52(6):1256-1265.

[4]Li H,Deng CQ,Chen BY,et al.Total saponins of Panax notogin?seng modulate the expression of caspases and attenuate apoptosis in rats following focal cerebral ischemia-reperfusion[J].J Ethnophar?macol,2009,121(3):412-418.

[5]Chen RX,Lv ZM,Chen MR,et al.Stroke treatment in rats with tail temperature increase by 40-min moxibustion[J].Neurosci Lett,2011,503(2):131-135.

[6]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cere?bral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[7] 肖愛嬌,陳日新,康明非,等.熱敏灸對腦缺血再灌注損傷模型大鼠SOD、MDA的影響[J].天津醫(yī)藥,2014,42(1):51-53.

[8]Kitagawa K,Matsumoto M,Tagaya M,et al.‘Ischemic tolerance’phenomenon found in the brain[J].Brain Res,1990,528(1):21-24.

[9]江君,楊巍巍,張楠，等.低氧預(yù)適應(yīng)減輕腦中動脈阻塞所致小鼠缺血性腦損傷[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2009,29(2):113-118.

[10]Gao M,Wu Y,Li GQ.Regulating effect of moxibustion pretreatment on Th1/Th2 imbalance of athletes during course of heavy load train?ing[J].Zhongguo Zhen Jiu,2011,31(3):247-251.

[11]華金雙,孫忠人.艾灸預(yù)處理抗腦水腫作用研究[J].針灸臨床雜志,2010,26(1):54-55.

[12]Solaroglu I,Cahill J,Tsubokawa T,et al.Granulocyte colony-stimu?lating factor protects the brain against experimental stroke via inhi?bition of apoptosis and inflammation[J].Neurol Res,2009,31(2):167-172.