山羊皮膚組織SCF基因的克隆與序列分析

張軍杰等

摘要：對山羊SCF基因的結(jié)構(gòu)與序列進(jìn)行了分析，參考山羊和綿羊SCF基因序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR克隆獲得了山羊SCF基因的兩個(gè)剪接體序列，同時(shí)對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，山羊SCF基因分泌型和跨膜型編碼區(qū)長度分別為825 bp和741 bp，長度差異主要是由外顯子6缺失/插入引起的，與綿羊和牛的同源性分別為98%和97%。13個(gè)物種的SCF基因的系統(tǒng)發(fā)育聚類與動(dòng)物分類學(xué)基本一致。

關(guān)鍵詞：山羊；SCF基因；分泌型；跨膜型

中圖分類號：S827；Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：0439-8114（2014）02-0450-03

Cloning and Sequence Analysis of SCF Gene in Goat Skin Tissue

ZHANG Jun-jie1，XI Jian-zhong1，ZHOU Rong-yan1，2，LI Xiang-long1，2，LI Lan-hui1，CHEN Hui1，

ZHANG Zhen-hong1，ZHAO Zhu-jun1，2

（1.College of Animal Science and Technology， Agricultural University of Hebei， Baoding 071001， Hebei， China；2.Embryo Engineering and Technological Centre of Cattle and Sheep of Hebei Province， Baoding 071001， Hebei， China）

Abstract： To investigate the structure and sequence of SCF gene in goat， primers were designed based on the sequence of goat and sheep. Two transcript splices were obtained with PCR and cloning and bioinformatics analysis of the sequence was made. The results showed that the length of coding sequence of soluble and transmembrane SCF gene in goat is 825 bp and 741 bp， respectively. The length difference was due to the deletion/insertion of 6th exon. The identity of SCF gene between goat and sheep or cattle was 98% and 97%， respectively. The phylogenetic clusters based on SCF gene sequence of thirteen species were the same as the zootaxy.

Key words： goat； SCF gene； soluble type； transmembrane type

哺乳動(dòng)物毛色是由體內(nèi)黑色素決定的，黑色素包括真黑素（Eumelanin）和褐黑素（Phenomelanin）。真黑素使毛發(fā)表現(xiàn)為褐色和黑色，褐黑素使毛發(fā)表現(xiàn)為黃色和紅色，兩種色素分布與比例的不同表現(xiàn)為哺乳動(dòng)物不同的毛色類型。黑色素存在于黑素細(xì)胞的黑素體中，這些黑素體在被毛的生長過程中通過胞吐作用轉(zhuǎn)移至被毛，黑素細(xì)胞的增殖與分化是黑色素產(chǎn)生的關(guān)鍵。

皮膚中的干細(xì)胞因子（Stem cell factor，SCF），也稱為kit配體或青灰因子，主要來源于角質(zhì)形成細(xì)胞，由于轉(zhuǎn)錄過程中存在著差異，干細(xì)胞因子在體內(nèi)以分泌型（s-SCF）和跨膜型（tm-SCF）兩種形式存在，通過其受體c-kit介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化等生物學(xué)功能。SCF/c-kit信號通路在調(diào)節(jié)黑素細(xì)胞的存活、分化、移行和增殖等過程中起重要作用[1]。在哺乳動(dòng)物中毛色是絨、毛、羔皮及裘皮用山羊的重要經(jīng)濟(jì)性狀，也是識(shí)別個(gè)體、血液系統(tǒng)和品種歸屬的遺傳標(biāo)志之一。因此，本研究克隆了山羊皮膚組織中的SCF基因序列，同時(shí)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析，并基于測定序列構(gòu)建了進(jìn)化樹，為進(jìn)一步研究SCF基因在毛色形成中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

EasyPure RNA Kit、pEASY-T3 Cloning Kit和感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Reverse Transcriptase M-MLV（RNase Hˉ）、Recombinant Ribonuclease Inhibitor和Oligo d（T）18 Primers購自寶生物工程（大連）有限公司；Taq DNA聚合酶和dNTPs購自天根生化科技（北京）有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒和SanPrep柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Taq MasterMix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 山羊皮膚組織總RNA的提取

取凍存的山羊皮膚組織，按照RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行總RNA的提取，并用核酸蛋白測定儀進(jìn)行濃度與純度的測定，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA第一鏈合成。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中山羊SCF基因序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)了3對特異性引物，由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。擴(kuò)增外顯子1-6的引物正向序列：5′-GCGCTGCCTTTCCTTATGA-3′，反向序列：5′-ATTACTGCTACTGCTGTCATTCCT-3′；擴(kuò)增外顯子5-7的引物正向序列：5′-GGACTTGGAGATAGTGGCTTC-3′，反向序列： 5′-CCATTGTAGGCTGGAATCT-3′；擴(kuò)增外顯子4-10的引物正向序列5′-GATAAGCGAGATGGTGGAA-3′，反向序列：5′-CATGGGTAGCAAGAACAGATAAA

G-3′。預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為621、195 （外顯子6缺失后為111 bp）和761 bp。

1.4 SCF基因克隆及遺傳進(jìn)化分析

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

所提取的皮膚組織總RNA以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶清晰。用核酸測定儀進(jìn)行測定RNA純度，OD260 nm/OD280 nm比值均在1.8～2.0之間。

2.2 山羊SCF基因序列擴(kuò)增結(jié)果

以cDNA為模版，利用3對引物PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。將PCR產(chǎn)物回收純化克隆測序，電泳條帶大小與預(yù)期大小一致。

2.3 山羊跨膜型與分泌型SCF基因序列分析

外顯子6含有切割位點(diǎn)，分泌型SCF基因開放閱讀框長度為825 bp，與綿羊和牛的核苷酸序列相似性分別為98%和97%，推測編碼274個(gè)氨基酸?？缒ば蚐CF基因開放閱讀框長度為741 bp，與牛的核苷酸序列相似性為97%，推測編碼246個(gè)氨基酸。經(jīng)過序列比對，確定了山羊SCF基因分泌型的核苷酸序列長度大于跨膜型是由于外顯子6的存在引起的。山羊SCF基因跨膜型與分泌型的結(jié)構(gòu)如圖2所示。

2.4 不同物種SCF基因的遺傳進(jìn)化分析

利用不同物種SCF基因編碼區(qū)序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。同一物種SCF基因跨膜型與分泌型先聚為一類，然后再與其他物種聚為一類。13個(gè)物種的SCF基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與動(dòng)物分類學(xué)基本一致。

3 小結(jié)與討論

干細(xì)胞因子通過與黑素細(xì)胞表面的c-kit受體結(jié)合，以控制黑素細(xì)胞生長、增殖與分化，SCF-kit通道的阻斷可抑制已分化黑素細(xì)胞的黑素形成[2]。黑素細(xì)胞來源于神經(jīng)嵴，SCF在胚胎發(fā)生過程中對黑素細(xì)胞的遷移起了決定性作用。SCF或kit基因的突變會(huì)導(dǎo)致人類色素沉著受損和小鼠皮毛色素缺失[3]。SCF-kit在調(diào)節(jié)皮膚組織中黑素細(xì)胞的數(shù)量和增殖活性中起著重要作用[4，5]。研究克隆得到了山羊皮膚組織中的兩個(gè)剪接體，經(jīng)過序列分析確定這兩個(gè)剪接體分別為跨膜型與分泌型SCF基因序列，且與其他物種具有較高的相似性，說明該基因在不同物種中具有較強(qiáng)的保守性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)山羊SCF基因分泌型的核苷酸序列長度大于跨膜型是由于外顯子6的存在引起的，這與SCF基因在其他物種中的剪接類型是相同的。

參考文獻(xiàn)：

[1] WEHRLE-HALLER B. The role of Kit-ligand in melanocyte development and epidermal homeostasis[J]. Pigment Cell Research，2003，16（3）：287-296.

[2] VANOVER J C， SPRY M L， HAMILTON L，et al. Stem cell factor rescues tyrosinase expression and pigmentation in discreet anatomic locations in albino mice[J]. Pigment Cell & Melanoma Research，2009，22（6）：827-838.

[3] LONGLEY B J， CARTER E L. SCF-KIT pathway in human epidermal melanocyte homeostasis[J]. Journal of Investigative Dermatology，1999，113（1）：139-140.

[4] 王大光，朱文元.干細(xì)胞因子對黑素細(xì)胞調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊，2003，29（5）：315-317.

[5] 沈丹蓓，曾學(xué)思.干細(xì)胞因子對人黑素細(xì)胞的作用和影響[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2003（5）：268-272.

G-3′。預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為621、195 （外顯子6缺失后為111 bp）和761 bp。

1.4 SCF基因克隆及遺傳進(jìn)化分析

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

所提取的皮膚組織總RNA以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶清晰。用核酸測定儀進(jìn)行測定RNA純度，OD260 nm/OD280 nm比值均在1.8～2.0之間。

2.2 山羊SCF基因序列擴(kuò)增結(jié)果

以cDNA為模版，利用3對引物PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。將PCR產(chǎn)物回收純化克隆測序，電泳條帶大小與預(yù)期大小一致。

2.3 山羊跨膜型與分泌型SCF基因序列分析

外顯子6含有切割位點(diǎn)，分泌型SCF基因開放閱讀框長度為825 bp，與綿羊和牛的核苷酸序列相似性分別為98%和97%，推測編碼274個(gè)氨基酸?？缒ば蚐CF基因開放閱讀框長度為741 bp，與牛的核苷酸序列相似性為97%，推測編碼246個(gè)氨基酸。經(jīng)過序列比對，確定了山羊SCF基因分泌型的核苷酸序列長度大于跨膜型是由于外顯子6的存在引起的。山羊SCF基因跨膜型與分泌型的結(jié)構(gòu)如圖2所示。

2.4 不同物種SCF基因的遺傳進(jìn)化分析

利用不同物種SCF基因編碼區(qū)序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。同一物種SCF基因跨膜型與分泌型先聚為一類，然后再與其他物種聚為一類。13個(gè)物種的SCF基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與動(dòng)物分類學(xué)基本一致。

3 小結(jié)與討論

干細(xì)胞因子通過與黑素細(xì)胞表面的c-kit受體結(jié)合，以控制黑素細(xì)胞生長、增殖與分化，SCF-kit通道的阻斷可抑制已分化黑素細(xì)胞的黑素形成[2]。黑素細(xì)胞來源于神經(jīng)嵴，SCF在胚胎發(fā)生過程中對黑素細(xì)胞的遷移起了決定性作用。SCF或kit基因的突變會(huì)導(dǎo)致人類色素沉著受損和小鼠皮毛色素缺失[3]。SCF-kit在調(diào)節(jié)皮膚組織中黑素細(xì)胞的數(shù)量和增殖活性中起著重要作用[4，5]。研究克隆得到了山羊皮膚組織中的兩個(gè)剪接體，經(jīng)過序列分析確定這兩個(gè)剪接體分別為跨膜型與分泌型SCF基因序列，且與其他物種具有較高的相似性，說明該基因在不同物種中具有較強(qiáng)的保守性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)山羊SCF基因分泌型的核苷酸序列長度大于跨膜型是由于外顯子6的存在引起的，這與SCF基因在其他物種中的剪接類型是相同的。

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G-3′。預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為621、195 （外顯子6缺失后為111 bp）和761 bp。

1.4 SCF基因克隆及遺傳進(jìn)化分析

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

所提取的皮膚組織總RNA以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳條帶清晰。用核酸測定儀進(jìn)行測定RNA純度，OD260 nm/OD280 nm比值均在1.8～2.0之間。

2.2 山羊SCF基因序列擴(kuò)增結(jié)果

以cDNA為模版，利用3對引物PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。將PCR產(chǎn)物回收純化克隆測序，電泳條帶大小與預(yù)期大小一致。

2.3 山羊跨膜型與分泌型SCF基因序列分析

外顯子6含有切割位點(diǎn)，分泌型SCF基因開放閱讀框長度為825 bp，與綿羊和牛的核苷酸序列相似性分別為98%和97%，推測編碼274個(gè)氨基酸?？缒ば蚐CF基因開放閱讀框長度為741 bp，與牛的核苷酸序列相似性為97%，推測編碼246個(gè)氨基酸。經(jīng)過序列比對，確定了山羊SCF基因分泌型的核苷酸序列長度大于跨膜型是由于外顯子6的存在引起的。山羊SCF基因跨膜型與分泌型的結(jié)構(gòu)如圖2所示。

2.4 不同物種SCF基因的遺傳進(jìn)化分析

利用不同物種SCF基因編碼區(qū)序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。同一物種SCF基因跨膜型與分泌型先聚為一類，然后再與其他物種聚為一類。13個(gè)物種的SCF基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與動(dòng)物分類學(xué)基本一致。

3 小結(jié)與討論

干細(xì)胞因子通過與黑素細(xì)胞表面的c-kit受體結(jié)合，以控制黑素細(xì)胞生長、增殖與分化，SCF-kit通道的阻斷可抑制已分化黑素細(xì)胞的黑素形成[2]。黑素細(xì)胞來源于神經(jīng)嵴，SCF在胚胎發(fā)生過程中對黑素細(xì)胞的遷移起了決定性作用。SCF或kit基因的突變會(huì)導(dǎo)致人類色素沉著受損和小鼠皮毛色素缺失[3]。SCF-kit在調(diào)節(jié)皮膚組織中黑素細(xì)胞的數(shù)量和增殖活性中起著重要作用[4，5]。研究克隆得到了山羊皮膚組織中的兩個(gè)剪接體，經(jīng)過序列分析確定這兩個(gè)剪接體分別為跨膜型與分泌型SCF基因序列，且與其他物種具有較高的相似性，說明該基因在不同物種中具有較強(qiáng)的保守性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)山羊SCF基因分泌型的核苷酸序列長度大于跨膜型是由于外顯子6的存在引起的，這與SCF基因在其他物種中的剪接類型是相同的。

參考文獻(xiàn)：

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[4] 王大光，朱文元.干細(xì)胞因子對黑素細(xì)胞調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 國外醫(yī)學(xué)皮膚性病學(xué)分冊，2003，29（5）：315-317.

[5] 沈丹蓓，曾學(xué)思.干細(xì)胞因子對人黑素細(xì)胞的作用和影響[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2003（5）：268-272.