高效液相色譜法同時(shí)測定癲癇清顆粒中3組分含量

張婧涵，王光函，鄒桂欣

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847； 遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

癲癇清顆粒由知母、白芍、制何首烏、石菖蒲等組方，具有豁痰熄風(fēng)、活血祛瘀、開竅益智的功效，臨床用于痰瘀內(nèi)阻的癇證，主治突然昏倒、不省人事、四肢抽搐、口吐涎沫、發(fā)作性短暫失神等。具有多酚結(jié)構(gòu)的芒果苷可通過減弱Ca2+內(nèi)流和氧化應(yīng)激程度，減少神經(jīng)元中谷氨酸引起的細(xì)胞死亡，從而達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的作用[1]。芍藥苷具有神經(jīng)保護(hù)作用[2]，且前期藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，其具有延長模型動(dòng)物驚厥潛伏期及睡眠時(shí)間，縮短睡眠潛伏期的作用。二苯乙烯苷是何首烏中特有的生物活性成分，其含量已成為何首烏藥材的專屬性指標(biāo)，具有顯著的腦保護(hù)功能[3]。目前單獨(dú)測定芒果苷、芍藥苷、二苯乙烯苷含量的方法報(bào)道較多[4-5]，但尚無同時(shí)測定三者方法的報(bào)道。筆者用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)的梯度洗脫技術(shù)，1次進(jìn)樣分離分析了制劑中分屬3味中藥的芒果苷、芍藥苷、二苯乙烯苷3種組分，為復(fù)雜體系的多組分同時(shí)定量測定及其全面質(zhì)量控制提供了簡便、準(zhǔn)確的方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜系統(tǒng)(四元泵，二極管陣列檢測器，自動(dòng)進(jìn)樣器)，F(xiàn)A1004型萬分之一天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；KQ-250DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。對照品芒果苷(批號為111607-200402)、芍藥苷(批號為110736-201136)、二苯乙烯苷(批號為110844-201109)，均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈、醋酸為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純；癲癇清顆粒(遼寧富東制藥有限公司，批號為20131101，20131102，20131103，規(guī)格為每袋 8 g)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:KromasilC18柱(250mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相:乙腈(A)和(B)0.2%醋酸水溶液兩相梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～10 min為15%A，10～20 min為15% ～25%A，20～25 min為25% ～34%A，25～30 min為 34% ～100%A；流速:1.0 mL/min；DAD 檢測器，檢測波長:0～9 min為 258 nm，9～17 min為230 nm，17～30 min為320 nm；柱溫:25℃。

2.2 溶液制備

分別取芒果苷、芍藥苷、二苯乙烯苷對照品各適量，精密稱定，加稀乙醇溶解，制成各對照品貯備液。精密量取各對照品貯備液適量，置同一容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，制成含芒果苷、芍藥苷、二苯乙烯苷質(zhì)量濃度分別為0.152，0.480，0.248 g/L的混合對照品溶液，搖勻，即得對照品溶液。取本品內(nèi)容物約1 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液備用，即得供試品溶液。以相同比例的處方，按樣品工藝分別制備缺知母、白芍、制何首烏的陰性樣品，并依法制備3種陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn):分別精密吸取對照品溶液5μL，供試品溶液及3種陰性對照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果表明，陰性樣品對測定無干擾，方法專屬性良好。

線性關(guān)系考察:精密吸取2.2項(xiàng)下混合對照品溶液1，2，4，6，8，10 μL，依法進(jìn)樣，記錄峰面積值。以對照品進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的峰面積值(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，芒果苷 Y=3 437X+85.4(r=0.999 1)，芍藥苷 Y=1 215X-4.5(r=0.999 5)，二苯乙烯苷 Y=3 500X-10.0(r=0.999 5)。結(jié)果表明，芒果苷、芍藥苷、二苯乙烯苷進(jìn)樣量分別在0.152～1.52，0.480～4.80，0.248～2.48 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn):精密吸取同一混合對照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果芒果苷、芍藥苷、二苯乙烯苷精密度的 RSD分別為0.50%，1.00%，0.52%(n=6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0，2，4，8，12，20 h時(shí)進(jìn)樣測定峰面積。結(jié)果芒果苷、芍藥苷、二苯乙烯苷的 RSD分別為2.20%，0.14%，0.64%(n=6)，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn):取本品粉末約1 g，平行6份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄色譜峰面積。結(jié)果芒果苷、芍藥苷、二苯乙烯苷含量的 RSD分別為2.8%，2.4%，2.9%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn):稱取本品粉末約0.5 g，平行9份，精密稱定，分別精密加入一定量的芒果苷、芍藥苷、二苯乙烯苷的對照品溶液，依法制備供試品溶液并測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 芒果苷、芍藥苷、二苯乙烯苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.4 樣品含量測定

取不同批號的樣品約1 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算各成分含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(mg/袋，n=3)

3 討論

檢測波長的選擇:芒果苷、芍藥苷、二苯乙烯苷的紫外最大吸收波長不同，分別為258，230，320 nm，相差較大，若在某一波長條件下測定，會導(dǎo)致其余二者的吸收較小。因此，采用波長切換法，選擇合適的出峰時(shí)間轉(zhuǎn)換相應(yīng)成分的波長，可以提高測定的靈敏度，且避免了出現(xiàn)基線漂移。

提取條件的優(yōu)化:試驗(yàn)中采用 L9(34)正交試驗(yàn)法，對提取溶劑(70%乙醇、50%乙醇、甲醇)、提取時(shí)間(20，30，60 min)和提取方法(浸泡、超聲、回流)進(jìn)行考察，并進(jìn)行方差分析。結(jié)果表明，提取溶劑及提取方法具有顯著性差異，50%乙醇提取效果最好，超聲和回流提取結(jié)果接近，均顯著高于浸泡，而提取時(shí)間沒有顯著性差異。綜合考慮各因素，最終確定最佳工藝為50%乙醇25mL、超聲30min。

多組分同時(shí)測定的意義:由于中藥作用的多途徑多靶點(diǎn)特性，在中藥新藥建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，多指標(biāo)成分的質(zhì)量控制比起單一指標(biāo)成分定量更具科學(xué)性，建立一種能簡便、快速地同時(shí)測定出多種組分的方法，將更有利于合理地控制中藥質(zhì)量。

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