海娜花抗真菌有效成分的提取工藝優(yōu)化與抑菌效力研究

(江蘇省鹽城市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 鹽城 224001)

海娜花，即指甲花 Lawsonia inermis L.，為千屈菜科 (Lythtaceae)散沫花屬植物，我國漢代《南方草木狀》中稱其為散沫花，1964年版《維吾爾醫(yī)常用藥材》中稱指甲花的維吾爾語名稱為Hina或Mihid，還指出其英文名稱為Henna。

1 儀器與試藥

DF-2型集熱式磁力加熱攪拌器(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-CA型循環(huán)水式多用真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；85-2A型恒溫磁力攪拌器(常州博遠實驗分析儀器廠)，LC-20型高效液相色譜儀(日本島津公司)。95%乙醇、甲醇(分析純，西隴化工)，磷酸二氫銨，磷酸；海娜花粉(天然植物粉，烏魯木齊印伊海娜有限公司)；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA，生化試劑，廣東環(huán)凱)，RPMI-1640液體培養(yǎng)基(生化試劑，賽默飛世爾)；白色念珠菌凍干粉(生化試劑，南京便診生物科技，CMCC98001)；刃天青。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜(HPLC)條件

色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相:A為30 mmol/L磷酸二氫銨，B為甲醇(用磷酸調(diào)pH=3)溶液，梯度洗脫；柱溫:30 ℃；進樣量:20 μL。

2.2 海娜有效成分提取方法優(yōu)化

2.2.1回流提取法

溶劑濃度選擇:稱量海娜花粉5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，分別加入50%，70%，90%乙醇50 mL，于80℃溫度下回流提取，每隔1 h取出液體，過濾，殘渣繼續(xù)加入50%，70%，90%乙醇50 mL回流提取，重復上述步驟3次。量取提取液10 mL，40℃減壓蒸干，用2 mL HPLC法流動相復溶，過0.22 μm微孔濾膜后，采用HPLC法檢測[1]。結(jié)果見表1?？梢?，90%乙醇回流提取時出峰晚，物質(zhì)的非極性高；用50%乙醇回流提取時出峰早，物質(zhì)的極性高；而70%乙醇介于兩者之間。因此，選擇70%乙醇作為優(yōu)化的回流提取溶劑。

表1 3種不同濃度乙醇回流提取液的峰面積比較

提取溫度選擇:稱量海娜花粉5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50mL，分別在60，80，100℃溫度下回流提取，每隔1h取出液體，過濾，殘渣繼續(xù)加入70%乙醇50mL，保持上述3個溫度回流提取，重復上述步驟3次。量取提取液10mL，40℃減壓蒸干，用2mL HPLC法流動相復溶，過0.22μm微孔濾膜后，采用HPLC法檢測。結(jié)果見表2。可見，100℃時的峰面積比60℃和80℃都要高，故此選擇100℃作為優(yōu)化的回流提取溫度。

表2 不同溫度下回流提取液的峰面積比較

提取時間選擇:稱量海娜花粉5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50 mL，100℃下分別回流0.5，1.0，1.5h，取出液體，過濾。量取提取液10mL，40℃減壓蒸干。用2mL HPLC法流動相復溶，過0.22μm微孔濾膜后，采用HPLC法檢測。結(jié)果見表3。可見，回流提取1.0h的峰面積比0.5h和1.5h的都要大，故提取時間選擇1.0h。

表3 不同提取時間回流提取液的峰面積比較

2.2.2超聲提取法

提取溫度選擇:稱量海娜花粉5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50 mL，分別在40，50，60℃溫度下超聲提取，每隔1 h取出液體，過濾，殘渣繼續(xù)加入70%乙醇50 mL，保持上述3個溫度超聲提取，重復上述步驟3次。量取提取液10 mL，40℃減壓蒸干，用2 mL HPLC法流動相復溶，過0.22 μm微孔濾膜后，采用HPLC法檢測。結(jié)果見表4。可見，50℃溫度下超聲提取的峰面積較高，故選用50℃作為超聲提取溫度。

表4 不同溫度下超聲提取液的峰面積比較

提取時間選擇:稱量海娜花粉5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50 mL，在50℃下超聲提取0.5，1.0，1.5 h，取出液體，過濾。量取提取液10 mL，40℃減壓蒸干，用2 mL HPLC法流動相復溶，過0.22 μm微孔濾膜后，采用HPLC法檢測。結(jié)果見表5?？梢?，超聲提取1.5 h的峰面積比0.5 h和1.0 h的都要高，故超聲提取時間選擇1.5 h。

表5 不同提取時間超聲提取液的峰面積比較

2.2.3相同條件下超聲提取法與回流提取法比較

稱量海娜花粉5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50mL，在60℃下分別回流提取和超聲提取，每隔1h取出液體，過濾，殘渣繼續(xù)加入70%的乙醇50 mL回流或超聲提取，重復上述步驟3次。量取提取液10mL，40℃減壓蒸干，用2 mL HPLC法流動相復溶，過0.22μm微孔濾膜后，采用HPLC法檢測。結(jié)果見表6。可見，在相同溫度和時間下，回流提取法的峰面積明顯大于超聲提取法，故相同條件下回流提取法的效果更佳。

表6 2種提取方法的峰面積比較

2.3 體外抑菌試驗

白色念珠菌的培養(yǎng):將白色念珠菌凍干粉活化后，挑取少許菌落轉(zhuǎn)種于PDA平板，28℃培養(yǎng)12d，用適量無菌生理鹽水沖洗平板，用無菌移液管尖端輕輕探劃白色念珠菌菌落，制備懸液。將含有分生孢子或孢囊孢子及菌絲片段的混懸液用無菌移液管移至無菌試管中，充分混勻靜置5 min，將上部均一懸液轉(zhuǎn)移到帶螺紋的無菌管中，旋緊蓋子，置旋渦混合器混勻15s。在分光光度計上讀取分生孢子或孢囊孢子懸液吸光度(A)，調(diào)整 A為0.15。制備的菌懸液用RPMI-1640培養(yǎng)基1∶50稀釋后，作為待接種物。

海娜花提取物稀釋液的制備:稱量海娜花粉5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50mL，在100℃溫度下回流提取，每隔1 h取出液體過濾，殘渣繼續(xù)加入70%乙醇50mL回流提取，重復上述步驟3次。合并3次的提取液，40℃減壓蒸干，精密稱取干浸膏適量，用RPMI-1640培養(yǎng)基配置成1 280μg/mL的貯備液。

接種:按照NCCLS M38-A方法[2]，將提取物稀釋液在無菌96孔板的第2列到第11列孔之間進行倍比稀釋，第1列孔裝RPMI-1640培養(yǎng)基200 μL，作為無菌對照，第2列到第11列孔裝倍比稀釋過的海娜花提取物稀釋液100 μL與菌懸液100 μL，第12列孔裝無菌生理鹽水100 μL與菌懸液100 μL，作為生長對照。各孔用槍頭吹打均勻，每個濃度設3個重復。

結(jié)果判定:將96孔板在28℃培養(yǎng)箱靜置孵育3 d，向各孔中加入比色指示劑刃天青，繼續(xù)孵育30 min后，觀察加樣孔的顏色。藍色表示無菌生長，紫色表示部分生長，紅色表示生長，最低抑菌濃度(MIC)值為顏色由藍色到紫色輕微改變時的最低藥物質(zhì)量濃度。試驗結(jié)果顯示，海娜花提取物對白色念珠菌的 MIC為320 ～640 μg/mL。

3 討論

20世紀70年代，Abd-E-l Malik等[3]采用薄層色譜法對指甲花葉乙醇提取物中具有抗菌活性的4種成分進行了分離，其中3種分別被鑒定為沒食子酸(gallic acid)、指甲花醌(lawsone，2-羥基-1，4-萘醌)和1，4-萘醌，并發(fā)現(xiàn)葉子提取物對葡萄球菌(Staphylococcus)、鏈球菌(Streptoccus)、布魯氏菌(Brucella)、沙門菌(Salmonella)有抵抗作用，但對綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)和白色念珠菌(Candida albican)卻沒有抑制作用。20世紀80年代，Afzal等[4]對從指甲花葉中提取的1，2-二羥基-4-葡糖氧基萘醌的抗菌活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)1，2-二羥基-4-葡糖氧基萘醌對枯草桿菌、酵母菌屬(Paslorianas)有抑制作用。另外，Malekzadeh等[5]的研究表明，指甲花的提取物在生物體外對多種革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有抑制作用，且指甲花提取物的抗菌活性與其所含的主要染色物質(zhì)指甲花醌有關。Awadh等[6]的研究也表明，指甲花的提取物(水、乙醇、乙酸乙酯提取物)具有抗菌活性，但未發(fā)現(xiàn)它有細胞毒活性。

溶劑濃度選擇時，乙醇濃度為70%時的提取效果最佳，而濃度較低或較高時的提取效率會明顯下降?？赡苁且驗槿軇舛容^低時，海娜花中的有效成分不能被完全提取出來；而溶劑濃度較高時，雖然有效成分能被完全提取出來，但其中部分成分可能已被破壞，從而導致提取效率降低。

回流提取時，溫度在100℃時的提取效果最佳，可能是由于溫度高時分子運動加快，溶解速度變快，從而提取率增加。超聲提取時，溫度在50℃時的提取率最高，可能是因為溫度太低有效成分不能被完全溶出，而溫度過高時雖然溶出率增加，但超聲和升溫同時會將部分有效成分分解，導致提取率降低。

回流提取時提取時間為1 h的效果最佳，時間過短提取不充分，而時間過長又會破壞有效成分。超聲提取時提取時間為1.5 h時的效果最佳，超聲溫度較低，即使提取時間達到1 h后有效成分仍不能被完全溶出，因而提取時間要比回流提取時長。

比較2種方法，在相同條件下，回流提取法的提取效率更高，可能是因為超聲提取時分子間的運動過于劇烈而致使有效成分被破壞，使提取率降低?；亓魈崛》ǖ淖罴压に嚄l件為:稱量海娜花粉5g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50mL，在100℃下回流提取1 h，取出液體，過濾，殘渣繼續(xù)加入70%乙醇50 mL回流，重復提取3次。超聲提取法的最佳工藝條件為:稱量海娜花粉5 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加入70%乙醇50 mL，在50℃下超聲提取1.5 h，取出液體，過濾，殘渣繼續(xù)加入70%乙醇50 mL超聲，重復提取3次。

海娜花提取物對白色念珠菌的 MIC為320～640 μg/mL，遠高于一般抗真菌藥物的 MIC值。這可能有兩方面原因:一是天然藥物提取物中的雜質(zhì)和無效成分較多，真正抗真菌的有效成分含量較低；二是筆者對于NCCLS M38-A方法還不能熟練掌握，可能產(chǎn)生了操作誤差[7-8]。因此，需要對海娜花提取物作進一步分離、純化，得到抗真菌成分較高的產(chǎn)物；同時，應更好地掌握NCCLS M38-A方法，提高測定的準確度。

參考文獻：

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[2]李厚敏，劉 偉，李若瑜.美國臨床實驗室標準化委員會2003年版產(chǎn)孢絲狀真菌藥敏試驗方案簡介[J].中華檢驗醫(yī)學雜志，2005，28(1):121-123.

[3]Abd-El-Malik Y.El-Leithy MA，Reda FA，et al，Antimcirobial principles in leaves of Lawsonia inermis[J].Zbl Bakt AbtⅡ，1973，128(1):61-67.

[4]Afzal M，Al-Oriquat G，Al-Hassan JM，et al.Isolation of 1，2-dihydroxynaphthalene from Lausonia inermis[J].Heterocycles，1984，22(4):813-816.

[5]Malekzadeh F，Shabestari PP.Therapeutic effects and in vitro activity of an extract from Lausonia inermis[J].J Sci Islamic Repub Iran，1989，1(1):7-12.

[6]Awadh Ali NA，Julich WD，Kusnick C，et al.Screening of Yemeni medicinal plants for antibacterial and cytotoxic activities[J].Journal of Ethnopharmacoligy，2001，74(2):173-179.

[7]刁有江，鄧旭明.皮膚癬菌微量液基稀釋法抗真菌先導化合物敏感性試驗方法的建立[J].中國農(nóng)學通報，2008，24(5):1-7.

[8]孫長貴，曾賢銘，楊 燕.絲狀真菌常規(guī)藥物敏感試驗及其質(zhì)量控制[J].臨床檢驗雜志，2006，24(5):382-384.