藤三七總黃酮的分離純化研究

蔣珍藕，邱宏聰，2，鄧聿胤

(1.廣西中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022； 廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室，廣西 南寧 530022)

藤三七為落葵科落葵薯屬多年生蔓生藤本植物落葵薯Anredera cordifolia (Tenore)Sreenis.[1]，是一種藥食同源的植物，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、活血化瘀、通脈止痛、調(diào)脂降血壓的功效，常用于治療腰膝痹痛、病后體弱、跌打損傷、高脂血癥等[2]。藥理研究表明，藤三七具有降血糖[3]、抗脂質(zhì)過氧化[4]、抗菌消炎[5-6]、抗HIV[7]等活性，主要成分為皂苷類和黃酮類化合物[7-8]。本試驗中以總黃酮含量為考核指標(biāo)，采用正交試驗優(yōu)選藤三七總黃酮分離純化工藝，為深入研究和開發(fā)利用藤三七奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

UV2550型紫外分光光度計(日本島津公司)；RE-52A型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；HH.SY21-Ni型電熱恒溫水浴鍋(北京市長風(fēng)儀器儀表公司)；DZF-6051型真空干燥箱(上海精密實驗設(shè)備有限公司)；B2200S型超聲清洗機(jī)(上海必能信超聲有限公司)；LIBROR AEL-200型電子天平(日本島津公司)。蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為080-9002)；乙醇為食用酒精(95%)，購自南寧市廣耀實驗裝備有限責(zé)任公司；水為蒸餾水；其余試劑均為分析純。大孔吸附樹脂DM130(西安藍(lán)深特種樹脂有限公司)；大孔吸附樹脂D101(西安藍(lán)曉科技有限公司)；聚酰胺樹脂(30～60目，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠，批號為20070706)，聚酰胺樹脂(80～100目，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為F20081009)，聚酰胺樹脂(100～200目，浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠，批號為20070206)。藥材采自南寧市馬山縣郊區(qū)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院饒偉源副主任中藥師和方鼎研究員鑒定為落葵科落葵薯屬多年生蔓生藤本植物落葵薯 Anredera cordifolia(Tenore)Sreenis.(地上部分)，在自然通風(fēng)條件下陰干。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮測定

2.1.1溶液制備

取蘆丁對照品適量，精密稱定，加75%乙醇制成每1mL含150μg的溶液，即得對照品溶液。取藤三七藥材粗粉0.5g，精密稱定，精密加入75%乙醇25mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率80W，頻率50kHz)60min，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.2檢測波長選擇

取蘆丁對照品溶液及供試品溶液適量，以試劑為空白參比液，分別置25mL容量瓶中，加75%乙醇5mL，再加5%亞硝酸鈉溶液1mL，搖勻，放置6min。加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min。加1mol/L氫氧化鈉試液10mL，再加75%乙醇至刻度，搖勻，放置15min，在400～800nm波長下掃描。結(jié)果蘆丁對照品溶液及供試品溶液均在512nm波長處有最大吸收，故選擇512nm作為檢測波長。

2.1.3線性關(guān)系考察

精密稱取蘆丁對照品12.4mg，置25mL容量瓶中，加75%乙醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備溶液，精密量取 0.5，1，2，4，6，8 mL，以相應(yīng)試劑為空白參比，分別置 25mL 容量瓶中，按2.1.2項下的顯色方法顯色，在512nm波長處測定吸光度(A值)。以蘆丁質(zhì)量濃度(μg/mL，X)為橫坐標(biāo)、A值(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=0.008 8X+0.0024(r=0.999 4)。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在 9.92～158.72μg/mL范圍內(nèi)與A值線性關(guān)系良好。

2.1.4測定法

取供試品溶液和對照品溶液適量，以相應(yīng)試劑為空白，分別置25mL容量瓶中，按2.1.2項下的顯色方法顯色，在512nm波長處測定吸光度并計算。

某高速公路項目全長115km，行車速度設(shè)計為100km/h，路基寬度設(shè)計為26.0m，本工程路面結(jié)構(gòu)為瀝青混凝土結(jié)構(gòu)，主線路面層為（SMA—13）細(xì)粒式瀝青混凝土面層，厚度為4cm；中面層為6cm（AC—20C）中粒式瀝青混凝土；下面層為8cm（AC—25C）粗粒式瀝青混凝土。在本項目路面排水設(shè)計中主要采用中央分離帶、超高緩和段的排水處理方法，最大限度減少平坡路段出現(xiàn)積水的現(xiàn)象。但是在實踐過程中，采用該方式不能達(dá)到理想的防排水效果?；诖?，相關(guān)部門在研究后從問題角度出發(fā)，在了解高速公路防排水設(shè)計應(yīng)用實際的基礎(chǔ)上，采取了優(yōu)化設(shè)計方式進(jìn)行。

2.2 分離純化工藝研究

2.2.1藤三七提取液制備

取藤三七藥材粗粉2kg，加12倍量75%乙醇回流提取2次，每次2h，合并提取液，濾過，濾液減壓回收乙醇至無醇味，加水定容至2000mL，搖勻(即藥材含量為1 g/mL，測定總黃酮濃度為45.42g/L)，備用。

2.2.2樹脂預(yù)處理

取樹脂，用95%乙醇溶液浸泡樹脂24 h，充分溶脹后用濕法裝柱，用95%乙醇以2 BV/h(B為倍，V為樹脂體積)的流速清洗，至流出液與水混合(1∶5)不呈白色混濁為止，再用蒸餾水清洗柱子至流出液無醇味，備用。量取樹脂時以樹脂在水中溶脹后的體積(mL)為單位。

2.2.3樹脂篩選

選擇2種不同型號(DM130，D101)的大孔吸附樹脂和3種不同規(guī)格(30～60，80～100，100～200目)的聚酰胺樹脂對藤三七中黃酮的吸附-洗脫性能進(jìn)行篩選試驗，優(yōu)選出對藤三七黃酮成分具有較好吸附洗脫性能的樹脂。取2.2.1項下藤三七提取液25 mL，加水至250 mL，攪勻，放置 24 h，濾過，濾液均分5份，作為上樣液。量取已處理好的上述5種樹脂各20 mL，分別用濕法裝柱，取上述上樣液以同樣流速分別上柱吸附，收集流出液，蒸干，測定其總黃酮含量，計算總黃酮吸附量[總黃酮吸附量(mg)=樣品總黃酮量-流出液總黃酮量]。然后分別用50%乙醇50 mL以同樣的洗脫流速進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，蒸干，測定其中的總黃酮含量，計算洗脫率。洗脫率(%)=洗脫液總黃酮量/總黃酮吸附量×100%。結(jié)果見表1。結(jié)果表明，聚酰胺樹脂(30～60目)的總黃酮吸附量和洗脫率均高于大孔吸附樹脂DM130和D101。80目以上的聚酰胺樹脂由于其樹脂粉末過細(xì)，流速極慢，甚至產(chǎn)生了堵塞，試驗中不好操作，結(jié)果放棄試驗。因此，綜合考慮各樹脂的吸附-洗脫性能及試驗操作的可行性，選擇30～60目的聚酰胺樹脂作為藤三七總黃酮分離純化的適用樹脂。

表1 不同吸附樹脂的吸附-洗脫性能測定結(jié)果

2.2.4吸附條件優(yōu)選

表2 吸附條件優(yōu)選因素水平表

表3 吸附條件優(yōu)選 L9(34)正交試驗結(jié)果

表4 吸附條件優(yōu)選方差分析表

2.2.5上樣量(藥材樹脂比)選擇

取2.2.1項下藤三七提取液5 mL，共2份，按上述正交試驗優(yōu)選的吸附條件上柱，收集流出液，蒸干，測定其總黃酮含量，并計算飽和吸附量。飽和吸附量(g/L)=(樣品總黃酮量-流出液總黃酮量)/樹脂體積。結(jié)果2份樣品平均飽和吸附量為4.62g/L，即每1 mL聚酰胺樹脂(30～60目)對總黃酮的飽和吸附量為4.62mg(約相當(dāng)于 0.1g藥材)，因此，上柱總黃酮量(mg)與所用樹脂(mL)的比例應(yīng)低于4.6∶1(即相當(dāng)于0.1g(藥材)/mL樹脂)。

2.2.6洗脫條件優(yōu)選

以總黃酮洗脫率為考察指標(biāo)，采用正交試驗，優(yōu)選聚酰胺樹脂(30～60目)對藤三七總黃酮的最佳洗脫條件。根據(jù)預(yù)試驗和參考有關(guān)柱色譜法分離純化文獻(xiàn)[10-11]，選取洗脫劑乙醇濃度(因素A)、洗脫劑乙醇用量(因素B)、洗脫流速(因素C)作為考察因素，每個因素設(shè)計3個水平，按L9(34)正交試驗表進(jìn)行試驗，因素水平見表5。取2.2.1項下藤三七提取液5mL，共9份，按上述正交試驗優(yōu)化條件吸附后的樹脂，按正交設(shè)計表進(jìn)行試驗，收集洗脫液，減壓濃縮，真空干燥，測定其中的總黃酮含量，并計算洗脫率。洗脫率(%)=洗脫液總黃酮量/(樣品總黃酮量-吸附后濾液總黃酮量)×100%。結(jié)果見表6，方差分析見表7。經(jīng)直觀分析和方差分析正交試驗結(jié)果，影響洗脫的因素主次順序為A＞B＞C，即洗脫劑乙醇濃度＞洗脫劑乙醇用量＞洗脫流速，但影響均無顯著性，最佳洗脫工藝條件為A2B2C2，即乙醇濃度為50%，乙醇用量為10 BV，洗脫流速為2 BV/h。

表5 洗脫條件優(yōu)選因素水平表

表6 洗脫條件優(yōu)選 L9(34)正交試驗結(jié)果

2.3 驗證試驗

取2.2.1項下藤三七提取液100 mL，共3份，分別按上述正交試驗優(yōu)化的吸附、洗脫條件進(jìn)行試驗。結(jié)果干膏中總黃酮含量分別為58.92%，56.67%，57.74%，RSD為1.95%，表明藤三七乙醇提取液經(jīng)聚酰胺樹脂(30～60目)分離純化后，干膏中總黃酮含量達(dá)50%以上，且重現(xiàn)性較好。

表7 洗脫條件優(yōu)選方差分析表

3 討論

聚酰胺樹脂對黃酮類成分具有較好的特異性吸附和解吸性能，可以使黃酮類成分得到有效分離和純化，筆者也曾用聚酰胺樹脂分離純化木姜葉柯總黃酮[12]，得到含量較高的總黃酮，本試驗再次用聚酰胺樹脂分離純化藤三七總黃酮，總黃酮含量達(dá)50%以上。

藤三七含有較多的黏液質(zhì)，因此藤三七提取液上柱前一定要選擇適宜的濾材濾過，或離心后取上清液，否則容易造成柱子堵塞，影響藤三七總黃酮的分離純化。

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