一株可降解孔雀石綠的肺炎克雷伯氏菌的分離與鑒定

李媛++張立強

摘要：孔雀石綠是一種具有致癌致畸作用的環(huán)境污染物。從武昌理工學(xué)院污水處理廠的活性污泥中分離得到一株可降解孔雀石綠的細菌，命名為MG-1。生理生化試驗分析初步鑒定該菌為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae），進一步的序列分析顯示該菌16S rDNA與肺炎克雷伯氏菌MBR11菌株的16S rDNA一致性達99%，進一步證明該菌為肺炎克雷伯氏菌。試驗證實肺炎克雷伯氏菌具有降解孔雀石綠的特性，其降解機理還有待于做進一步研究。

關(guān)鍵詞：孔雀石綠；肺炎克雷伯氏菌；16S rDNA

中圖分類號：S949 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）02-0298-03

Isolation and Characterization of a Malachite Green-degrader Klebsiella pneumoniae

LI Yuan1，ZHANG Li-qiang2

（1.Wuhan Environmental Monitoring Center，Wuhan 430015， China；2.Institute of Fishery Research of Wuhan City，Wuhan 430207，China）

Abstract： Malachite Green is a type of environmental pollutant inducing cancer and abnormality. A bacterium with the capability of degrading malachite green was isolated from the sludge sample collected from wastewater system of Wuchang university of Technology and designated as strain MG-1. According to the physiological-biochemical characteristics， it was preliminarily identified as Klebsiella pneumoniae. The 16S rDNA sequence analysis revealed that it has 99% homology with Klebsiella pneumoniae strain MBR11. All the data indicated that it was a Klebsiella pneumoniae stain. A further study is needed to explore the degradation mechanism.

Key words： Malachite Green； Klebsiella pneumoniae； 16S rDNA

孔雀石綠（C23H25ClN2，Malachite Green，MG）是一種合成的三苯甲烷類工業(yè)染料，被廣泛用于制陶業(yè)、紡織業(yè)、皮革業(yè)、食品顏色劑和細胞化學(xué)染色劑等領(lǐng)域[1]，也可用來治療各類水生動物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等[2-4]。但是研究表明，孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物無色孔雀石綠在魚體內(nèi)和環(huán)境中殘留時間長，它們分子中含有的化學(xué)官能團——三苯甲烷被確證具有高毒、高殘留、“三致”等毒副作用[5，6]。在2002年5月農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《食品動物禁用的獸藥及其他化合物清單》上，孔雀石綠屬于禁用藥物。由于中國的水產(chǎn)養(yǎng)殖曾經(jīng)長期使用孔雀石綠，導(dǎo)致水環(huán)境的嚴重污染，因此借助有效的工具消除環(huán)境中積累的孔雀石綠就顯得十分必要。以微生物降解為基礎(chǔ)的生物修復(fù)技術(shù)是消除環(huán)境中孔雀石綠污染的有效方法。 目前已報道的孔雀石綠降解菌主要有細菌中的假單胞菌（Pseudomonas sp.）、芽孢桿菌（Bacillus sp.）、節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）等[7-12]，但鮮見克雷伯氏菌屬（Klebsiella）的細菌降解孔雀石綠的報道。本研究從武昌理工學(xué)院污水處理廠的活性污泥中分離到1株能降解孔雀石綠的細菌，通過16S rDNA序列鑒定為肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）。該菌株的獲得豐富了孔雀石綠降解菌株的多樣性，并為孔雀石綠污染廢水的處理提供了菌株資源。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基與試劑

1.2 菌株篩選

1.3 菌株生化鑒定

菌株培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h，取固體斜面的新鮮培養(yǎng)物，經(jīng)革蘭氏染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察菌落形態(tài)； 其他各項生理生化試驗參照文獻[14]進行； 根據(jù)細菌的形態(tài)特征及生理生化反應(yīng)參照文獻[15]鑒定至種。

1.4 菌株分子學(xué)鑒定

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與生化鑒定結(jié)果

2.2 菌株16S rDNA基因序列分析

以菌株的基因組DNA為模板，利用細菌16S rRNA基因通用引物16S rDNA-F、16S rDNA-R進行PCR擴增，得到長度為1 532 bp的擴增產(chǎn)物（圖1）。將此序列用Blast進行比對，結(jié)果顯示該序列與肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）編號為MBR11的菌株的16S rDNA一致性（Identities）達99% （圖2）。目前細菌分類學(xué)家普遍認為當某2個細菌的16S rRNA一致性大于95%時，可將其歸為同一屬[14]。根據(jù)上述相似性比較結(jié)果，再結(jié)合生理生化特性將該菌株鑒定為克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）

3 討論

孔雀石綠作為一種染料及漁用殺菌劑曾在中國廣泛使用，然而大量研究表明孔雀石綠及其代謝產(chǎn)物具有致癌致畸作用，目前中國已經(jīng)將其列為漁類養(yǎng)殖禁用藥物，但是已經(jīng)在環(huán)境中積累及違法使用的孔雀石綠污染物依然存在，并且將長期危害環(huán)境。微生物降解孔雀石綠是一種既經(jīng)濟又實用的生物學(xué)手段。本研究分離到一株降解菌MG-1，經(jīng)過生理生化分析并結(jié)合16S rDNA基因序列相似性分析將其初步鑒定為Klebsiella sp.，其降解機理有待進一步研究。

參考文獻：

[1] CULP S J，BELAND F A. Malachite green： A toxicological review[J]. International Journal of Toxicology，1996，15（3）：219-238.

[2] 陳石娟.百姓餐桌不能承受之「綠」：孔雀石綠，又一次牽動著業(yè)界的神經(jīng)[J]. 海洋與漁業(yè)，2012（3）：32-34.

[3] 郭少忠，王少敦，郭桂忠.出口鰻魚藥物殘留的成因追溯及調(diào)控措施[J].海洋與漁業(yè)，2007（11）：10-11.

[4] 許奕端.常見魚類細菌性疾病的防治[J].海洋與漁業(yè)，2006（8）：44-45.

[5] SRIVASTAVA S， SINHA R， ROY D. Toxicological effects of Malachite green[J]. Aquatic Toxicology，2004，66（3）：319-329.

[6] 朱偉杰，侯瑜瓊.孔雀石綠對小鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)的影響[J].生殖與避孕，2008，28（2）：70-73.

[7] GANESH P， SATISH K， GANESH S， et al. Biodegradation of Malachite green by Kocuria rosea MTCC 1532[J]. Acta Chimica Slovenica，2006，53：492-498.

[8] 陳 亮，林永慧，何興兵，等.煙管菌降解孔雀石綠染料的多因素優(yōu)化分析[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（16）：36-37.

[9] 程 迎，甘 莉，陳祖亮. Burkholderia cepacia對水中孔雀石綠的降解[J].福建師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，28（1）：87-91.

[10] 任 倩，蔣麗娟，宋 煒，等.孔雀石綠降解菌M3的分離鑒定及降解特性研究[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報，2007，23（3）：65-69.

[11] 曾慶龍，周元祥，劉 秀，等.孔雀石綠脫色菌的分離鑒定及降解特性研究[J].合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，35（10）：1391-1396.

[12] 張彤晴，李旭光，周 剛，等.孔雀石綠降解菌M3的發(fā)酵培養(yǎng)及對養(yǎng)殖水體孔雀石綠的降解效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（2）：265-267.

[13] 房桂華. 孔雀石綠降解菌Arthrobacter sp.M6的分離及降解特性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2010，16（4）：581-584.

[14] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001.370-410.

[15] KRIEG N R， HOLT J G. Bergeys manual of systematic bacteriology[M]. Voleme 1. Bltimore：Williams & Wilkins，1984. 461-465.

參考文獻：

[1] CULP S J，BELAND F A. Malachite green： A toxicological review[J]. International Journal of Toxicology，1996，15（3）：219-238.

[2] 陳石娟.百姓餐桌不能承受之「綠」：孔雀石綠，又一次牽動著業(yè)界的神經(jīng)[J]. 海洋與漁業(yè)，2012（3）：32-34.

[3] 郭少忠，王少敦，郭桂忠.出口鰻魚藥物殘留的成因追溯及調(diào)控措施[J].海洋與漁業(yè)，2007（11）：10-11.

[4] 許奕端.常見魚類細菌性疾病的防治[J].海洋與漁業(yè)，2006（8）：44-45.

[5] SRIVASTAVA S， SINHA R， ROY D. Toxicological effects of Malachite green[J]. Aquatic Toxicology，2004，66（3）：319-329.

[6] 朱偉杰，侯瑜瓊.孔雀石綠對小鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)的影響[J].生殖與避孕，2008，28（2）：70-73.

[7] GANESH P， SATISH K， GANESH S， et al. Biodegradation of Malachite green by Kocuria rosea MTCC 1532[J]. Acta Chimica Slovenica，2006，53：492-498.

[8] 陳 亮，林永慧，何興兵，等.煙管菌降解孔雀石綠染料的多因素優(yōu)化分析[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（16）：36-37.

[9] 程 迎，甘 莉，陳祖亮. Burkholderia cepacia對水中孔雀石綠的降解[J].福建師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，28（1）：87-91.

[10] 任 倩，蔣麗娟，宋 煒，等.孔雀石綠降解菌M3的分離鑒定及降解特性研究[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報，2007，23（3）：65-69.

[11] 曾慶龍，周元祥，劉 秀，等.孔雀石綠脫色菌的分離鑒定及降解特性研究[J].合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，35（10）：1391-1396.

[12] 張彤晴，李旭光，周 剛，等.孔雀石綠降解菌M3的發(fā)酵培養(yǎng)及對養(yǎng)殖水體孔雀石綠的降解效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（2）：265-267.

[13] 房桂華. 孔雀石綠降解菌Arthrobacter sp.M6的分離及降解特性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2010，16（4）：581-584.

[14] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001.370-410.

[15] KRIEG N R， HOLT J G. Bergeys manual of systematic bacteriology[M]. Voleme 1. Bltimore：Williams & Wilkins，1984. 461-465.

參考文獻：

[1] CULP S J，BELAND F A. Malachite green： A toxicological review[J]. International Journal of Toxicology，1996，15（3）：219-238.

[2] 陳石娟.百姓餐桌不能承受之「綠」：孔雀石綠，又一次牽動著業(yè)界的神經(jīng)[J]. 海洋與漁業(yè)，2012（3）：32-34.

[3] 郭少忠，王少敦，郭桂忠.出口鰻魚藥物殘留的成因追溯及調(diào)控措施[J].海洋與漁業(yè)，2007（11）：10-11.

[4] 許奕端.常見魚類細菌性疾病的防治[J].海洋與漁業(yè)，2006（8）：44-45.

[5] SRIVASTAVA S， SINHA R， ROY D. Toxicological effects of Malachite green[J]. Aquatic Toxicology，2004，66（3）：319-329.

[6] 朱偉杰，侯瑜瓊.孔雀石綠對小鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)的影響[J].生殖與避孕，2008，28（2）：70-73.

[7] GANESH P， SATISH K， GANESH S， et al. Biodegradation of Malachite green by Kocuria rosea MTCC 1532[J]. Acta Chimica Slovenica，2006，53：492-498.

[8] 陳 亮，林永慧，何興兵，等.煙管菌降解孔雀石綠染料的多因素優(yōu)化分析[J].湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（16）：36-37.

[9] 程 迎，甘 莉，陳祖亮. Burkholderia cepacia對水中孔雀石綠的降解[J].福建師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，28（1）：87-91.

[10] 任 倩，蔣麗娟，宋 煒，等.孔雀石綠降解菌M3的分離鑒定及降解特性研究[J].生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報，2007，23（3）：65-69.

[11] 曾慶龍，周元祥，劉 秀，等.孔雀石綠脫色菌的分離鑒定及降解特性研究[J].合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，35（10）：1391-1396.

[12] 張彤晴，李旭光，周 剛，等.孔雀石綠降解菌M3的發(fā)酵培養(yǎng)及對養(yǎng)殖水體孔雀石綠的降解效果[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（2）：265-267.

[13] 房桂華. 孔雀石綠降解菌Arthrobacter sp.M6的分離及降解特性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2010，16（4）：581-584.

[14] 東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京：科學(xué)出版社，2001.370-410.

[15] KRIEG N R， HOLT J G. Bergeys manual of systematic bacteriology[M]. Voleme 1. Bltimore：Williams & Wilkins，1984. 461-465.