連續(xù)相變萃取去除蓖麻粕中蓖麻堿新工藝研究

廖明娟 藺萬煌 曹 庸

LIAO Ming－juan 1 LIN Wan－h(huán)uang 1 CAO Yong 2

歐陽文3 周雙德1 李昌珠1

OUYANG Wen 3 ZHOU Shuang－de 1 LI Chang－zhu 1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學植物激素與生長發(fā)育湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；3.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙 410208；4.湖南省林業(yè)科學院，湖南 長沙 410004）

（1.Key Laboratory of Phytohormones and Growth Development，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642，China；3.Pharmaceutical College of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha，Hunan 410208，China；4.Hunan Academy of Forestry，Changsha，Hunan 410004，China）

蓖麻（Ricinus communis L.）是世界十大油料作物之一，去油后粕中除含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸及微量元素等多種營養(yǎng)物質(zhì)外，還含有0.23%的蓖麻堿［1］。蓖麻堿是一種小分子生物堿，具有較強的毒性［2］。研究［3］表明，人體攝入蓖麻堿后可造成惡心、嘔吐、出血性胃腸炎、肝臟和腎功能損害、抽搐、昏迷、低血壓、呼吸抑制甚至死亡。當飼料中蓖麻堿含量超過0.01%時可抑制雞的生長，含量超過0.1%時可使雞麻痹致死［3］。

目前，國內(nèi)外主要使用物理、化學、微生物法和聯(lián)合法來對蓖麻粕粕脫毒［4－7］。雖已取得了一定的成效，但同時也存在各方面的弊端和不足，物理脫毒法工藝一般比較復雜，耗能較大；化學脫毒工藝較簡單，但是需添加化學物質(zhì)，營養(yǎng)成分受損；微生物發(fā)酵法脫毒時間過長，且不能保證其營養(yǎng)成分不流失。因此各種脫毒方法很難在實際生產(chǎn)中進行工業(yè)化生產(chǎn)，故開發(fā)蓖麻脫毒的新工藝成為該領域研究的熱點。

本研究擬采用一種新型的具有自主產(chǎn)權(quán)的連續(xù)相變萃取裝置［8］去除蓖麻粕中的蓖麻堿，利用該裝置具有密閉、高效低溫和低壓的特點，探討一種簡單高效、省時、耗能低和營養(yǎng)成分不流失的新型脫毒工藝。通過考察溫度、時間和萃取壓力對蓖麻堿去除率的影響，對蓖麻堿去除工藝條件進行優(yōu)化，為蓖麻粕用作蛋白飼料提供技術(shù)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蓖麻粕：油含量低于3%，湖南省金匯有限公司；

電子天平：AL104型，梅特勒—托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：DHG－9070型，上海一恒科學儀儀器有限公司；

連續(xù)相變萃取：珠海共同機械有限公司；

冷凍干燥機：FD－1DF型，北京德天佑科技發(fā)展有限公司；

高效液相色譜儀：LC－10A型，日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 蓖麻堿的提取及結(jié)構(gòu)鑒定 蓖麻粕按1∶10（m∶V）的比例加入甲醇，超聲（超聲頻率為40 k Hz，超聲功率為250 W）提取0.5 h，重復2次，將粗提物濃縮凍干后，采用中壓柱層析色譜法以及高效制備液相色譜法進行分離，得到蓖麻堿。首先采用高效液相色譜分析單體化合物的純度，然后采用核磁共振儀測定化合物的磁共振譜（1H－NMR、13CNMR），鑒定單體化學結(jié)構(gòu)。

1.2.2 蓖麻堿高效液相色譜（HPLC）分析條件 反相色譜柱C18（250 mm×4.6 mm，25μm）；流動相：乙腈—水（1∶9），流速：1 m L／min；檢測波長：308 nm；進樣量：10 L［9］。

1.2.3 標準曲線的繪制 準確配制1 mg／m L蓖麻堿標準溶液，然 后 將 其 分 別 配 制 成 濃 度 為 0.8，0.6，0.4，0.2，0 mg／m L的標樣進行HPLC檢測，制作標準曲線。

1.2.4 響應面優(yōu)化連續(xù)相變萃取去除蓖麻堿的試驗設計

在單因素試驗基礎上，根據(jù)Box－Behnken中心組合設計原理，選取脫毒溫度、時間和萃取壓力為考察因素，試驗因素水平見表1，以蓖麻堿去除率為響應值，進行中心組合試驗設計。采用Design－expert 7.0對所得數(shù)據(jù)進行分析處理。

1.2.5 營養(yǎng)成分的測定

（1）粗蛋白測定：根據(jù)GB／T 6432—1994進行；

（2）粗纖維測定：根據(jù)GB／T 6434—2006進行；

（3）粗脂肪測定：根據(jù)GB／T 6433—2006進行；

（4）粗灰分測定：根據(jù)GB／T 6438—2007進行；

（5）鈣測定：根據(jù)GB／T 6436—2002進行；

（6）磷測定：根據(jù)GB／T 6437—2002進行。

表1 Box－Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and their level of Box－behnken experimental design

2 結(jié)果與討論

2.1 蓖麻堿結(jié)構(gòu)鑒定

由于目前市場上尚無法購得蓖麻堿標準品，本試驗參考張海悅等的方法［10］以確定蓖麻堿。然后再對該物質(zhì)進行核磁共振分析，氫譜和碳譜結(jié)果為1H－NMR（600 MHz，CDCl3）δ：6.073（1H，d，J＝7.5 Hz，5－H），7.535（1H，d，J＝7.5 Hz，6－H），4.011（3H，s，OCH3），3.564（3H，s，NCH3）。13C－NMR（150 MHz，CDCl3）δ：161.286（C－2），88.717（C－3），172.363（C－4），93.363（C－5），143.444（C－6），57.111（－ OCH3），37.551（－NCH3），113.614（－CN）。分析可得其化學式為3－氰基－4－甲氧基－1－甲基－2－吡啶酮，分子式為C8H8N2O2，確定該物質(zhì)為蓖麻堿。此結(jié)果與張海悅等［10］的報道相吻合。

2.2 蓖麻堿含量標準曲線的繪制

利用本試驗提取得到的蓖麻堿作為標準品，采用HPLC檢測蓖麻堿含量，見圖1。以蓖麻堿含量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，其回歸方程為y＝7 005.2x＋475 401（R2＝0.996 7）。

圖1 蓖麻堿的HPLC圖譜Figure 1 HPLC diagram of ricinine

2.3 響應面分析

根據(jù)Box－Behnken中心組合設計原理，選用溫度、時間和萃取壓力3個影響因素，以蓖麻堿去除率為響應值（R），響應面試驗設計及結(jié)果見表2。

利用Design－Expert對試驗數(shù)據(jù)進行分析，得到溫度、時間、萃取壓力3個因素的三元二次回歸模型：

對此回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，該模型達到顯著性差異（P＝0.020 5），失擬項不顯著（P＝0.071 2）。R2＝0.826 2，說明該模型能解釋82.62%的響應值的變化，各因素值和響應值之間的關(guān)系可以用該模型函數(shù)化，并不需要引入更高次數(shù)的項，可以用該模型代替試驗點對試驗結(jié)果進行分析和預測。其中，B和A2為顯著性因素，即溫度、時間和萃取壓力3個影響因素中，時間對蓖麻堿去除率的影響力最為顯著（P＝0.004 4）。

2.4 響應曲面及等高曲線分析

表2 Box－Benhnken試驗設計及結(jié)果Table 2 Box－Benhnken experimental design arrangement and experimental results

表3 回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for the regression model

為了使各因素及其相互作用能有效直觀的反映，采用Design－expert分析軟件繪制響應面曲線及等高值線，見圖2～4。由圖2可知，當時間不變時，蓖麻堿的去除率隨溫度升高而增大，到達最高點后又隨之減小；當溫度不變時，蓖麻堿的去除率隨時間的延長呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢。由圖3可知，當保持溫度不變時，蓖麻堿去除率隨著萃取壓力的升高先降低；當萃取壓力一定時，蓖麻堿去除率隨溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。由圖4可知，當時間保持一定時，蓖麻堿去除率隨著萃取壓力的升高而呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢；在萃取壓力一定時，蓖麻堿去除率隨著時間的升高呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢。

2.5 最優(yōu)蓖麻堿去除條件的確定及驗證實驗

為了檢驗預測的優(yōu)化培養(yǎng)條件，按照模型給出的優(yōu)化條件：溫度、時間、泵壓相對應的編碼值分別為0.34，0.47，－1，將其轉(zhuǎn)化為實際參數(shù)值，得出溫度為76.8℃，時間為2.25 h，萃取壓力為0.1 MPa，此時蓖麻堿去除率的模型理論預測值為92.01%。采用以上所得最佳脫毒條件進行驗證實驗，經(jīng)3次平行實驗測得蓖麻堿去除率為91.75%與預測值相比，相對誤差為0.002 6，表明預測值和實際值有很好的擬合性，證明該響應面分析方法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準確可靠，具有較高的應用價值。

圖2 溫度和時間對蓖麻堿去除率影響的曲面和等高線Figure 2 Curved surfaces and contours affected by temperature and time on the removal of ricinine

圖3 溫度和萃取壓力對蓖麻堿去除率影響的曲面和等高線Figure 3 Curved surfaces and contours affected by temperature and extracting pressure on the removal of ricinine

2.6 脫毒前后蓖麻粕中各營養(yǎng)成分的測定

由表4可知，除粗脂肪外，脫毒前后其余各營養(yǎng)成分并無明顯變化，這是由于脂肪類物質(zhì)可能在甲醇萃取過程中被帶至解析斧中，使粗蛋白含量相對有所增加，其他營養(yǎng)成分變化差異并不明顯。粗脂肪的去除，可以防止蓖麻粕蛋白的氧化酸敗，有利于長期保存。整體來說，該脫毒方法對蛋白和礦物質(zhì)元素等營養(yǎng)成分變化并不明顯。脫毒后蓖麻粕的蛋白質(zhì)含量為39.30%。

3 結(jié)論

表4 脫毒前后各成分含量的變化Table 4 Content of each componential before and after detoxification ／%

蓖麻餅粕中含有約0.36%的蓖麻堿，在作為飼料之前必須進行脫毒處理。本研究主要應用新型的脫毒工藝——連續(xù)相變萃取法脫毒，在單因素的基礎上，重點對脫毒時間、溫度和萃取壓力及其相互作用進行探討，經(jīng)響應面優(yōu)化法獲得蓖麻堿脫毒的最佳條件為脫毒溫度76.8℃，時間2.25 h，萃取壓力0.1 MPa。在該條件下蓖麻堿去除率為91.75%，此時蓖麻堿含量約為0.03%。在此條件下經(jīng)脫毒后的蓖麻粕無需過多的后續(xù)處理即可直接添加到飼料中，添加量可達30%。脫毒后的蓖麻粕跟脫毒前的蓖麻粕除粗脂肪外其余營養(yǎng)成分并沒有太大變化，在保證了粗蛋白等主要養(yǎng)分不流失的情況下，達到了很好的脫毒效果，為蓖麻粕作為動物蛋白飼料奠定了基礎，同時也為緩解蛋白飼料供需偏緊的局面［11，12］和大豆的大量進口［13，14］帶來福音。

圖4 萃取壓力和時間對蓖麻堿去除率影響的曲面和等高線Figure 4 Curved surfaces and contours affected by extracting pressure and time on the removal of ricinine

應用連續(xù)相變萃取蓖麻堿脫毒條件，具有以下優(yōu)勢：① 對比現(xiàn)有脫毒工藝［1，4，6］，該工藝僅以甲醇為萃取劑，且脫毒后蓖麻粕中甲醇殘留量少，只需在60℃烘箱進行揮發(fā)即可直接添加到飼料中，無需水洗等過程。② 萃取劑可反復回收利用，與常規(guī)方法相比，該工藝流程簡單、可操作性強，生產(chǎn)成本低，溶劑消耗和能耗低，脫毒效率高，營養(yǎng)成分不流失，污染小，重復性好，可實現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化連續(xù)性生產(chǎn)。③ 整個脫毒過程在密閉條件下進行，因此在保證高去除率的情況下，還能保證營養(yǎng)成分的不流失。④ 中國蓖麻粕資源豐富，此研究可有效提高蓖麻粕的綜合利用效率，同時也解決了蛋白飼料緊缺的一大問題。

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