水解時間對玉米蛋白粉酶解物抗氧化活性的影響

楊 雙 鄭喜群 劉曉蘭 周利敏 馬艷秋

YANG Shuang 1，2 ZHENG Xi－qun 1，2 LIU Xiao－lan 1，2 ZHOU Li－min 1，2 MA Yan－qiu 1，2

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

（1.College of Food and Biological Engineering，Qiqihar University，Qiqihar，Heilongjing 161006，China；2.Key Constructive Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang，Province Normal University，Qiqihar，Heilongjing 161006，China）

玉米蛋白粉酶解獲得的酶解物，經(jīng)物理處理后，可制備出具有多種生理功能的玉米肽，具有促進(jìn)乙醇代謝［1］，消除運(yùn)動后的疲勞［2］，降低血糖［3］和降血壓［4］等功能。玉米肽主要是分子量＜1 000 Da的短肽，可以被腸道內(nèi)直接吸收，而且吸收速度要比游離氨基酸和蛋白質(zhì)快2～3倍，從而更能發(fā)揮其生物功能［1］。

玉米肽的許多生理功能與其抗氧化活性有關(guān)，抗氧化活性主要是用于評價樣品清除自由基的能力。要想了解玉米肽的綜合抗氧化能力就要通過檢測玉米肽對O·、·OH、DPPH等自由基的清除能力，及其與Fe2＋的螯合能力和將Fe3＋還原成Fe2＋的能力。

復(fù)合蛋白酶（protamex）通常用作多種酶分步水解谷物蛋白的研究［5］，或者用于研究單酶水解谷物蛋白條件的優(yōu)化［6］，以追求更大的水解度和可溶性蛋白含量，然而Protamex單獨水解谷物蛋白的可溶性蛋白含量較堿性蛋白酶或多酶復(fù)合水解效果低4倍以上，所以極少有學(xué)者研究Protamex單酶作用玉米蛋白的功能性質(zhì)［5］，也未曾有報道表明前人有對Protamex酶解物做過如此全面的抗氧化活性研究。玉米蛋白的功能性質(zhì)之一——抗氧化活性與其分子量分布密切相關(guān)［7］，所以本研究擬通過改變水解時間來控制Protamex水解玉米蛋白粉的水解度，制備出不同分子量分布的玉米肽［7］，并研究其抗氧化活性變化，探究水解時間對玉米肽抗氧化活性的影響，進(jìn)而對Protamex酶解物的抗氧化活性的機(jī)制研究提供依據(jù)，也為提高這類原料的附加值，改善其功能特性，為開創(chuàng)良好的經(jīng)濟(jì)和社會效益服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

玉米蛋白粉：黑龍江龍鳳玉米開發(fā)有限公司；

α－淀粉酶：酶活30 U／g，北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；

復(fù)合蛋白酶：食品級，酶活13.59萬U／g，由枯草桿菌發(fā)酵產(chǎn)生，諾維信公司；

三羥甲基氨基甲烷（Tris）：色譜純，上海生工生物股份有限公司；

其余藥品：均為實驗室常規(guī)分析純。

1.2 試驗儀器和設(shè)備

雙螺桿擠壓膨化機(jī)：DS32－Ⅱ型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；

722型紫外分光光度計：TU－1901型，上海精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司；

高速離心機(jī)：CF15RX型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；

集熱式磁力加熱攪拌器：DF－Ⅰ型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 樣品的制備和提取

1.3.1 玉米蛋白粉的預(yù)處理

玉米蛋白粉→過80目篩→擠壓膨化→去淀粉→去色素→預(yù)處理后蛋白粉

對玉米蛋白粉進(jìn)行預(yù)處理主要是利用擠壓膨化的高溫、高壓和高剪切力的作用，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如其中蛋白質(zhì)的三、四級結(jié)構(gòu)的結(jié)合力變?nèi)?，分子間氫鍵、二硫鍵等部分?jǐn)嗔?，使物料形成結(jié)構(gòu)相對疏松、多孔的膨化物料；另外，玉米蛋白粉中含有8%～10%的淀粉，與玉米蛋白緊密連接，形成層層包裹很難剝離開的復(fù)合體，也影響了玉米黃粉中蛋白的酶水解速度。所以酶解反應(yīng)前采用一定的預(yù)處理方法使蛋白適當(dāng)變性，破壞蛋白的高級結(jié)構(gòu)，使玉米蛋白在分子內(nèi)部的某些基團(tuán)暴露在蛋白質(zhì)分子的表面上，從而改善玉米蛋白粉的水溶性，增加蛋白酶對玉米蛋白的作用位點；有利于酶對玉米蛋白的水解。玉米蛋白粉預(yù)處理具體方法參照文獻(xiàn)［6］。

1.3.2 樣品酶解 底物濃度5%（m／V）（用微量凱氏定氮法測定預(yù)處理后的玉米蛋白粉蛋白含量是81.57%），調(diào)節(jié)料液的p H至7.0，溫度為60℃時，再加入0.81% （m／V）的Protamex（酶 活 13.59 萬 U／g），分 別 酶 解 15，30，60，90，120 min。酶解過程用2 M NaOH滴定保持p H恒定，記錄消耗NaOH的體積。酶解完成后于90℃水中滅酶10 min，4 000 r／min離心15 min，上清液再經(jīng)定性濾紙（中速，型號102）過濾，即獲得玉米肽液，冷凍抽干制成玉米肽粉后于干燥器中保存［6］。不同水解時間制得樣品分別標(biāo)記為P－15，P－30，P－60，P－90，P－120。1.4 水解相關(guān)指標(biāo)測定

（1）酶活測定：按SB／T 10317—1999執(zhí)行；

（2）水解度：p H－stat法［8］；

（3）可溶性蛋白含量：福林酚法［8］。

1.5 玉米肽的分子量分布

采用體積排阻色譜法，運(yùn)用高分離度凝膠色譜預(yù)裝柱Superdex Peptide 10／300 GL（10×300～310 mm），及 Purifier100蛋白純化儀測定。流動相為 p H 7.0（20 mmol／L）含0.15 M NaCl 的 磷 酸—磷 酸 鹽 （PBS）緩 沖 液，流速0.25 m L／min，在波長214 nm下檢測。配制玉米肽濃度為2 mg／m L（標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)樣濃度為2 mg／m L），進(jìn)樣前過0.22μm的微孔過濾膜，進(jìn)樣量100μL。

1.6 抗氧化活性測定

玉米肽抗氧化的各指標(biāo)測定中所用的樣品濃度均為10 mg／m L，充分溶解后4 000 r／min離心15 min，取上清液進(jìn)行測試，并用0.05%的Vc作對照。每個樣品的每個指標(biāo)平行測定3次，結(jié)果取平均值。

1.6.1 清除DPPH自由基的測定 根據(jù)Shimada等的方法［9］，修改如下：取2 m L 0.1 m M DPPH 無水乙醇溶液加入2 m L樣液里，混合均勻，避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測其吸光值為Ai；另取2 m L待測樣品于試管中，分別加入無水乙醇2 m L，避光反應(yīng)20 min，在517 nm處測吸光值；以2 L 0.1 m M DPPH無水乙醇溶液和2 m L無水乙醇反應(yīng)作為參比，測吸光值。其清除率計算：

式中：

K——對DPPH自由基的清除率，%；

A0——2 m L 0.1 m M 的 DPPH 無水乙醇溶液加2 m L無水乙醇的吸光值；

Ai——2 m L 0.1 m M 的 DPPH 無水乙醇溶液加2 m L待測樣品的吸光值；

Aj——2 m L無水乙醇加2 m L待測樣品的吸光值。

1.6.2 清除·OH的測定 采用鄰二氮菲—Fe2＋氧化法［10］。

（1）依 次 加 入 0.15 mmol／L PBS 1 m L、去 離 子 水0.5 m L搖勻；加入0.75 mmol／L FeSO40.5 m L，充分混勻；加入0.01%H2O20.5 m L，振蕩1 min；加入0.75 mmol／L鄰二氮菲無水乙醇溶液0.5 m L，37℃水浴60 min；在536 nm處檢測反應(yīng)體系的吸光度值；

（2）以0.5 m L去離子水替代1.6.2（1）中的0.5 m L H2O2，其余條件同1.6.2（1），測其吸光度值；

（3）分別以不同玉米肽溶液（或 Vc）0.5 m L替代1.6.2（1）中的去離子水，測其吸光度值。清除率計算：

式中：

D——對·OH自由基的清除率，%；

AS——待測 樣 品 代 替 1.6.2（1）中 去 離 子 水 后在536 nm處的吸光值；

AP——反應(yīng)體系在536 nm處的吸光值；

AB——用去離子水代替 H2O2參與1.6.2（1）反應(yīng)時，其在536 nm處的吸光值；

式中：

I——抑制率，%；

V0——對照組鄰苯三酚自氧化速率，A／min；

VS——樣品組鄰苯三酚自氧化速率，A／min。

1.6.4 與鐵離子螯合能力的測定 根據(jù) Kong等［12］的方法，修改如下：取0.5 m L的樣品溶液，加入1 m L 20μM FeCl2，混勻后加入0.5 m M 菲洛嗪（ferrozine）溶液1 m L，劇烈震蕩搖勻，室溫下靜置10 min，在563 nm處測定吸光值，以等體積去離子水取代樣品溶液作為對照所測吸光值。

式中：

R——螯合率，%；

A0——對照組參與以上反應(yīng)后在563 nm處的吸光值；

AS——樣品組參與以上反應(yīng)后在563 nm處的吸光值。

1.6.5 還原力測定 參照 Oyaizu等［13］的方法。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

以上各項測定均做3次重復(fù)，用Excel軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 水解時間對水解度及可溶性蛋白含量的影響

表1 Protamex水解時間對玉米蛋白粉水解度及可溶性蛋白含量的影響Table 1 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis of CGM and the content of soluble protein by protamex

由表1可知，Protamex在前15 min時作用效果較快，隨著水解時間的增加，水解度值和可溶性蛋白含量也隨之增大，但是15 min到120 min之間的水解度增長幅度很小，而可溶性蛋白含量最高增長了166.4%。由此看來，Protamex水解預(yù)處理后玉米蛋白粉的水解度和可溶性蛋白含量與水解時間呈正相關(guān)。水解度和可溶性蛋白含量在水解時間達(dá)到60 min后增長幅度緩慢，水解體系在進(jìn)行到一定程度后會達(dá)到水解平衡，即使繼續(xù)延長水解時間其水解度和可溶性蛋白含量均可能不再增加，所以水解時間最大選在120 min，再延長水解時間意義不大。

2.2 水解時間對玉米肽的相對分子質(zhì)量分布的影響

由表2可知，Protamex作用預(yù)處理后玉米蛋白粉15～120 min，分子量分布范圍較大，其中10～17 k Da的大分子蛋白含量呈減少趨勢；1 900～2 300 Da范圍內(nèi)的蛋白含量與水解時間成負(fù)相關(guān)；Protamex作用玉米蛋白粉制得的主要組分是450～700 Da之間的短肽，并且短肽的含量與水解時間總體呈現(xiàn)正相關(guān)?？梢姡鈺r間可以有效影響Protamex對預(yù)處理后玉米蛋白粉的作用，15～120 min期間可逐漸將1 900～10 000 Da的大分子肽轉(zhuǎn)化成＜700 Da的短肽，Protamex單獨作用玉米蛋白粉120 min所得＜700 Da的短肽含量可達(dá)88.74%。并且有研究表明，肽的抗氧化活性與相對分子質(zhì)量大小有關(guān)［7］，活性較強(qiáng)抗氧化肽的氨基酸殘基數(shù)目一般在20個以內(nèi)［14］。玉米肽的抗氧化能力與分子量密切相關(guān)，而分子量過大或過小其抗氧化能力均不能達(dá)到最好，但當(dāng)玉米肽中的短肽含量適中，且含有某些能與自由基反應(yīng)的特殊基團(tuán)，即供氫基團(tuán)，而只有當(dāng)玉米肽分子量適中時這些特殊的供氫基團(tuán)才能最大限度的被暴露出來并與自由基反應(yīng)，體現(xiàn)更大的抗氧化活性［15，16］。

表2 水解時間對玉米肽分子量分布的影響Table 2 Effect of hydrolysis time on molecular weight distribution of corn peptide ／%

2.3 水解時間對玉米肽抗氧化活性的影響

圖1 水解時間對玉米肽抗氧化活性的影響Figure 1 Effect of hydrolysis time on antioxidant activity of corn peptide

2.3.2 對酶解物清除·OH能力的影響 由圖1可知，玉米肽清除·OH的能力與Protamex水解玉米蛋白粉的水解時間成正相關(guān)，并且在水解30 min時清除能力顯著加強(qiáng)，當(dāng)水解 到 120 min 時 達(dá) 最 大 值 為 （19.82±0.90）%，是0.05%Vc清除能力的72.13%。雖然用此方法玉米肽對·OH的清除率值并不高，但是與Vc比較，玉米肽對·OH的作用還是比較強(qiáng)的，而·OH是已知的氧自由基中最強(qiáng)的氧化劑，它可以起動脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，幾乎可以和所有細(xì)胞成分反應(yīng)，對機(jī)體的危害極大。試驗表明，短肽占比多時對清除·OH有更好的效果，水解時間的延長可以促進(jìn)更多與·OH結(jié)合的基團(tuán)裸露出來。

2.3.3 對酶解物清除DPPH能力的影響 由圖1可知，玉米肽在清除DPPH的能力與Protamex水解玉米蛋白粉的水解時間無顯著相關(guān)性，不同水解時間樣品對DPPH自由基的清除均有較好的效果，水解15，30，60 min所制玉米肽都達(dá)到61%左右，且無顯著差異，在水解到90 min和120 min時有所增加，清除率達(dá)到67%左右，達(dá)到0.05%Vc清除率的70.1%。而DPPH是人工合成的大分子自由基，它的化學(xué)穩(wěn)定性來自共振穩(wěn)定作用及3個苯環(huán)的空間障礙，從而使夾在其中間氮原子上的未成對電子不能發(fā)揮其應(yīng)有的電子成對作用。DPPH因具有單電子而使其在517 nm處有一強(qiáng)吸收（呈深紫色），當(dāng)存在自由基清除劑時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)成定量關(guān)系，因而可廣泛用于自由基清除劑和抗氧化劑的篩選分析［18］。較高的清除DPPH自由基的能力說明本試驗中的樣品具有較強(qiáng)的提供質(zhì)子的能力，質(zhì)子與自由基結(jié)合后就可以阻止自由基對機(jī)體細(xì)胞的氧化損傷。

2.3.4 對酶解物與Fe2＋的螯合能力的影響 由圖1可知，玉米肽顯示出了很強(qiáng)的與Fe2＋的螯合能力，在水解15 min時螯合率即可達(dá)到（82.08±0.43）%，但也體現(xiàn)出其螯合率與水解時間成反比關(guān)系，在水解到120 min時降至（74.44±1.95）%，而0.05%的 Vc卻沒有與Fe2＋螯合的能力。在這一點大大優(yōu)于堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉制取的玉米肽，Kong等［12］研究表明堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉制取的玉米肽幾乎沒有與Fe2＋螯合的能力。這種較強(qiáng)的與Fe2＋螯合的能力可以使玉米肽抑制Fenton反應(yīng)和Harber－Weiss反應(yīng)，即：

從而減少·OH的產(chǎn)生，直接或間接減少了很多自由基的連鎖氧化反應(yīng)，Protamex水解物獨具的與Fe2＋螯合的能力對其后續(xù)的功能性產(chǎn)品研發(fā)具有重要意義。

2.3.5 對酶解物還原能力的影響 由圖2可知，玉米肽的還原能力與水解時間有正相關(guān)趨勢，從水解15 min的0.145±0.001增加到120 min的0.217±0.002，而0.05%的Vc還原能力達(dá)到了0.788±0.007。玉米肽的還原能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于0.05%Vc的效果。雖然Protamex酶解物的還原力相對不高，但是其仍然具備一定的提供電子的能力，對金屬離子引起的氧化起到一定的預(yù)防作用。

圖2 水解時間對玉米肽還原力的影響Figure 2 Effect of hydrolysis time on reduce power of corn peptide

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，Protamex的水解作用可有效改善玉米蛋白粉的溶解性，水解度和可溶性蛋白含量與水解時間均呈正相關(guān)；Protamex作用玉米蛋白粉的水解時間決定了酶解物的分子量分布，而酶解物的分子量分布不同體現(xiàn)了不同的抗氧化活性，然而并不是短肽的含量高就對各種自由基有較好的清除能力，分子量＜700 Da的玉米短肽含量占60%以上對清除DPPH自由基和與Fe2＋的螯合能力較強(qiáng)，而對清除O·能力和還原能力較弱，但是P－120的綜合抗氧化能力可與0.05%的Vc標(biāo)準(zhǔn)品相媲美。

自由基是機(jī)體正常代謝的產(chǎn)物，對于機(jī)體的正常代謝有一定的促進(jìn)作用，但是機(jī)體內(nèi)的自由基只能逐漸增多而不會缺失，過多的自由基會引起機(jī)體衰老、細(xì)胞損傷、死亡和組織傷害、細(xì)胞癌變等，所以適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充外源抗氧化劑對機(jī)體有特殊的意義。采用Protamex水解玉米蛋白粉2 h即可獲得高效、較綜合的抗氧化活性劑，這為玉米蛋白粉擁有更多良好的應(yīng)用前景奠定了基礎(chǔ)。

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