選擇性識別酪胺分子印跡聚合物的制備及其表征

田艷麗 朱秋勁 臺紅杏 黃雨杰 張孝剛

TIAN Yan－li 1 ZHU Qiu－jin 1 TAI Hong－xing 1 HUANG Yu－jie 1 ZHANG Xiao－gang 2

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563003）

（1.College of Liquor Making and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China；2.Medical College of Zunyi，Zunyi，Guizhou 563003，China）

酪胺又名對羥基苯乙胺（分子量137.18），是一類含氮低分子量的單胺類生物胺，對血管和肌肉有著明顯的舒張和收縮作用，對精神活動和大腦皮層具有重要的調(diào)節(jié)作用［1］。該化合物具有升高血壓和興奮子宮的藥理作用，可用來制備偏頭痛的藥物［2］。生物胺廣泛存在于各類食品中，在富含蛋白質(zhì)和氨基酸的食品中相對較多［3］，其中發(fā)酵香腸、泡菜、干酪、酸奶、葡萄酒［4］、黃酒［5］等發(fā)酵食品在發(fā)酵過程中容易產(chǎn)生生物胺。通常，少量的酪胺不會對人體產(chǎn)生影響，但當(dāng)積累到一定的濃度時(shí)，不僅影響食品風(fēng)味，甚至對人體產(chǎn)生毒害作用［6－8］。在正常的食用植物油中并不含有生物胺，地溝油中生物胺主要由其原料中腐敗變質(zhì)的蛋白質(zhì)所產(chǎn)生，為地溝油所特有［9］。目前中國尚無鑒別地溝油的依據(jù)，而測定其中生物胺含量，不但可以對地溝油進(jìn)行鑒別，而且還能測定其中對人體有毒害作用的生物胺類物質(zhì)［9］。目前常用的酪胺檢測方法包括酶生物傳感器法［10］、薄層色譜法［11］、氣相色譜法［12］、高效液 相 色 譜 法［13］、電 泳 法［14］等。但 是 這 些 方 法的成本較高，且在檢測前需要進(jìn)行復(fù)雜的預(yù)處理，應(yīng)用很不方便。

分子印跡技術(shù)是近來集高分子合成、分子識別、分子設(shè)計(jì)等眾多學(xué)科優(yōu)勢發(fā)展起來的一門邊緣學(xué)科分支，近幾十年來在國內(nèi)外的發(fā)展十分迅猛，在多個(gè)領(lǐng)域都得到了應(yīng)用。其基本原理是在一定的制孔劑（如甲醇、乙腈、二甲基亞砜、二氯甲烷等）中，模板分子和功能單體依靠分子間的相互作用構(gòu)成單體—模板分子復(fù)合物；再加入交聯(lián)劑，在引發(fā)劑的作用下，聚合形成穩(wěn)定的高交聯(lián)的聚合物；選用合適的溶劑洗脫模板分子，制備出具有選擇吸附性能的聚合物［15］。聚合物具有容易制備、化學(xué)性質(zhì)相對穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛的應(yīng)用于食 品［16，17］、環(huán) 境［18］、生 物［19，20］及 藥 物［21，22］等 領(lǐng) 域。分 子印跡聚合物在目標(biāo)物的分離富集檢測方面有很好應(yīng)用，利用其特異選擇吸附結(jié)合性能，與傳感器聯(lián)用可以構(gòu)建酪胺的快速檢測方法。因此，分子印跡技術(shù)在食品安全檢測方面具有重要的應(yīng)用潛力［16］。

本研究擬以酪胺為模板分子，丙烯酰胺（AM）為功能單體，采用本體聚合的方法，制備聚合物。通過吸附動力學(xué)和吸附等溫試驗(yàn)，對其吸附性能進(jìn)行研究；并且選擇結(jié)構(gòu)類似物組胺研究印跡聚合物的分子識別特性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

酪胺（tyramine）、丙烯酰胺（acrylamide，AM）：純度大于99.9%，美國Sigma－Aldrich公司；

乙二醇二甲基丙烯酸酯（ethylene glycol dimethacrylate，EGDMA）：99%，百靈威科技有限公司；

偶氮二異丁腈（2，2＇－azobis（2－methyl），AIBN）：分析純，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司；

乙 腈：HPLC 級，Tedia Company，Inc.，1000 Tedia Way，F(xiàn)airfield，OH45014.USA；

甲醇、冰醋酸：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

氮?dú)猓嘿F州省貴陽市花溪區(qū)永勝工業(yè)氣體。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

超聲波清洗儀：HB 3120U型，江蘇漢邦科技有限公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：TU－1810型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

數(shù)顯恒溫振蕩器（水?。篧HY－2型，上海梅香儀器有限公司；

恒溫恒濕培養(yǎng)箱：CLHN－350T型，天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；

磁力攪拌器（自行改裝后四套并排組裝可控轉(zhuǎn)速）：CJ78－1型，金壇市城東新瑞儀器廠；

電熱恒溫水浴鍋：HH－S6型，北京科偉永興儀器有限公司；

冰箱：BCD－235CM 型，合肥美的榮事達(dá)電冰箱有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101－2A型，天津市泰斯特儀器有限公司；

高效液相色譜儀：1260 Infinity型，美國 Agilent Technologies公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：VECTOR22 FTIR型，德國Bruker光譜儀器公司。

1.2 分子印跡聚合物的制備

取0.5 mmol（67.5 mg）酪胺溶解在50 m L的甲醇中，加入4 mmol（284.3 mg）AM 功能單體，室溫下超聲促溶，于4℃冰箱中預(yù)聚合12 h。再加入10 mmol（1.9 m L）EGDMA和20 mg AIBN，混勻后通氮?dú)?0 min以除去混合液中溶解的氧氣，將反應(yīng)器密封于3～4℃、365 nm紫外光照射，恒速磁力攪拌下聚合48 h。采用相同的方法，不加模板分子制備酪胺的非印跡聚合物（NIPs）。

取出聚合后的三角瓶，于超聲波下超聲3次分散聚合物，過濾除去溶劑。干燥后研磨過篩（400目），用10%冰醋酸甲醇溶液于索氏抽提裝置，抽提48 h（75℃水?。┏ツ０宸肿?，洗滌聚合物至在波長216 nm處檢測不到酪胺分子的特征吸收，用丙酮沉降除去精細(xì)粒子，真空干燥后備用。

1.3 分子印跡聚合物的表征

利用傅立葉變換紅外光譜儀，采用溴化鉀（KBr）壓片法測定酪胺、MIPs－AM 和 NIPs－AM 在4 000～400 cm－1范圍內(nèi)的紅外光譜圖，并分析比較。

1.4 模板分子和功能單體相互作用的紫外光譜分析

1.4.1 單體AM加入量對預(yù)組裝體系的紫外光譜測定 取2 mmol／L酪胺甲醇溶液120μL加入10 m L比色管中，分別加入濃度為3 mmol／L的單體AM甲醇溶液，使酪胺與單體AM濃度比分別為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，用甲醇定容至10 m L，振蕩混勻后于4℃靜置12 h，以相應(yīng)濃度單體AM甲醇溶液為參比，于350～190 nm進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.4.2 預(yù)組裝體系的差示紫外光譜測定 取2 mmol／L酪胺甲醇溶液120μL加入10 m L比色管中，分別加入濃度為3 mmol／L的單體甲醇溶液，使酪胺與單體AM濃度比分別為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，用甲醇定容至10 m L，振蕩混勻后置于4℃靜置12 h，以酪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比，于350～190 nm進(jìn)行紫外光譜掃描。

1.5 MIPs對酪胺的吸附動力學(xué)試驗(yàn)

于一組10 m L帶塞離心管中各取印跡聚合物20 mg，加入10μmol／m L的酪胺水溶液5 m L，于30℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱中振蕩不同的時(shí)間，高速離心機(jī)10 000 r／min離心10 min，然后取離心液1 m L，衍生后用乙腈定容至5 m L［23］，于高效液相上檢測。根據(jù)上清液中剩余的酪胺的濃度，按式（1）計(jì)算聚合物對酪胺的吸附量Q，觀察吸附量Q隨時(shí)間的變化趨勢。

式中：

Q——聚合物的吸附量，μmol／g；

C0、C1——分別是吸附前后模板分子的初始濃度和平衡濃度，μmol／m L；

V——溶液的體積，m L；

MMIPs——印跡聚合物的質(zhì)量，mg［22］。

1.6 吸附等溫線的測定

于一組10 m L帶塞離心管中各取印跡聚合物MIPs和非印跡聚合物NIPs 20 mg，分別加入不同濃度的酪胺水溶液5 m L，于30℃恒溫水浴振蕩培養(yǎng)箱中振蕩8 h，高速離心機(jī)10 000 r／min離心10 min，然后取離心液1 m L，衍生乙腈稀釋定容至5 m L，于高效液相上檢測。根據(jù)吸附前后酪胺濃度的變化，計(jì)算平衡時(shí)MIPs和NIPs的吸附量Q。

1.7 酪胺分子印跡聚合物的特異性吸附

取1.0μmol／m L的酪胺水溶液和組胺水溶液各5 m L，分別加入印跡聚合物MIPs和非印跡聚合物NIPs各20 mg，于30℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩不同的時(shí)間，10 000 r／min離心10 min，取離心液1 m L，衍生乙腈稀釋定容至5 m L，于高效液相上檢測。根據(jù)吸收峰面積的大小，計(jì)算平衡時(shí)酪胺的濃度，通過前后濃度的變化，得到單位質(zhì)量的聚合物對酪胺和組胺的吸附量。

1.8 高效液相色譜檢測條件

色譜柱：Hanbon Sci.＆ Tech.Dai ODS－P柱（4.6 mm ×250 mm，5μm）；流動相A為乙腈，流動相B為水，乙腈的梯度洗脫程序：0～5 min（65%～70%），5～20 min（70%～100%），20～24 min（100%），24～25 min（100%～65%）；流速為1 m L／min；檢測波長為216 nm；進(jìn)樣量20μL；柱溫為30℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 酪胺、MIPs和NIPs的紅外光譜試驗(yàn)

酪胺、MIPs和NIPs的紅外光譜結(jié)構(gòu)表征見圖1。圖中印跡聚合物和非印跡聚合物的紅外圖譜峰形相似，且MIPs中沒有看到酪胺苯環(huán)C骨架伸縮振動的特征峰（1 595.06，1 515.77，1 483.28 cm－1），這說明 MIPs中的模板分子已經(jīng)洗脫干凈。酪胺屬于芳胺類化合物，C—N的伸縮吸收相當(dāng)強(qiáng)，接近1 300 cm－1；酪胺是伯胺，有兩個(gè)N—H鍵，3 335.63 cm－1和3 283.24 cm－1為 N—H 鍵的對稱和反對稱伸縮振動吸收峰。在MIPs和NIPs的紅外圖中，3 436.28，3 436.26 cm－1為 N—H 的 伸 縮 吸 收 峰；2 998.16，2 955.35 cm－1和 2 987.39，2 955.39 cm－1是—CH3或—CH2的反對稱和對稱伸縮振動吸收峰；1 388.89，1 453.43 cm－1和 1 389.12，1 453.17 cm－1為—CH3的 對稱彎曲振動和反對稱彎曲振動吸收峰；酰胺的C═O譜帶低于酮的羰基吸收峰，在1 690～1 630 cm－1處；因?yàn)榫酆衔锸怯梢叶级谆┧狨ィ‥DGMA）作交聯(lián)劑聚合得來，而酯的C═ O伸縮振動稍高于酮，所以在1 726.39，1 726.86 cm－1處可以看到酯的C═O的伸縮振動吸收峰；在1 157.10，1 262.84 cm－1和1 157.14，1 261.51 cm－1處有酯的C—O—C的不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動吸收峰［22］。

2.2 模板分子酪胺和功能單體AM聚合前相互作用的紫外光譜分析

2.2.1 單體AM的加入量對預(yù)組裝體系紫外光譜測定 印跡聚合物對模板分子識別是因?yàn)槟０宸肿优c印跡聚合物上的互補(bǔ)作用位點(diǎn)的可逆相互作用。因此，研究聚合前模板分子和功能單體預(yù)組裝體系的相互作用對于探討印跡聚合物的識別機(jī)理有一定的意義［24］。

圖1 酪胺、MIPs－AM和NIPs－AM的紅外光譜Figure 1 IR spectra of tyramine，MIPs－AM and NIPs－AM

圖2 單體的加入量對預(yù)組裝體系紫外光譜的影響Figure 2 Effect of monomer content on pre－assembed system UV spectrum

由圖2可知，隨著AM濃度的增加，預(yù)組裝體系的紫外光譜吸光值呈降低的趨勢，這說明酪胺與單體AM的相互作用逐漸增大，而且預(yù)組裝體系的最大吸收波長發(fā)生了紅移現(xiàn)象，這是由于模板分子酪胺的助色團(tuán)羥基（—OH）和氨基（—NH2）通過氫鍵與功能單體的生色團(tuán)羧基（—COOH）或酰胺基（—CONH2）相互作用，功能單體中羰基—C═O的電子吸收能量發(fā)生π－π＊躍遷，使得生色團(tuán)的吸收峰向長波方向移動。

2.2.2 預(yù)組裝體系差示紫外光譜測定 差示紫外光譜經(jīng)常用于研究分子印跡預(yù)組裝體系中結(jié)合常數(shù)K和主客體之間的化學(xué)配比n［25－27］。該方法主要是通過檢測模板與模板－單體混合物的差示吸光度ΔA，然后繪制差示吸光度ΔA和單體濃度bn（n＝1、2、3……代表結(jié)合反應(yīng)的摩爾比）的化學(xué)配位數(shù)冪bn之比ΔA／bn與ΔA的曲線，通過曲線的線性相關(guān)度來計(jì)算n和K［27］。

圖3 預(yù)組裝體系的差示紫外光譜圖Figure 3 Pre－assembed system UV spectrum of differential

參照文獻(xiàn)［27］、［28］，酪胺（TYR）與丙烯酰胺（AM）的結(jié)合反應(yīng)公式推導(dǎo)和整理得如下表達(dá)式：

式中：

ΔA——差示吸光度；

a——酪胺的濃度，mmol／L；

b——丙烯酰胺（AM）的濃度，mmol／L；

K——TYR與AM的結(jié)合反應(yīng)常數(shù)；

Δε——TYR－AM復(fù)合物與AM的摩爾吸光系數(shù)差值，L／（mol·cm）；

n——復(fù)合物的配位比，取n＝1，2，3，……。

圖4 224 nm處ΔA／bn對ΔA的關(guān)系圖Figure 4 Plots ofΔA／b n vs，ΔA at 224 nm

根據(jù)差示紫外光譜測定得到的吸光值，以ΔA／bn對ΔA作圖，由圖4可知，當(dāng)n＝1時(shí)，對ΔA 作圖可以看作是一條直線，相關(guān)系數(shù)是0.935 5，顯示了比較良好的線性。當(dāng)n取2，3，4時(shí)，相關(guān)系數(shù)分別是0.790 8，0.647 4，0.545 5，沒有良好的線性。這說明1個(gè)酪胺分子主要是與1個(gè)AM分子形成TYR－AM 型復(fù)合物，K＝31.711×103L／mol。

2.3 MIP對酪胺的吸附動力學(xué)分析

按照1.5試驗(yàn)方法測定不同的吸附時(shí)間MIPs對酪胺的吸附量，以時(shí)間T為橫坐標(biāo)，對吸附量Q作圖，得到聚合物的吸附動力學(xué)曲線，見圖5。由圖5可知，前4 h聚合物的吸附量隨著時(shí)間的延長而迅速增加，4 h后吸附速率有所下降，8 h后逐漸趨于平穩(wěn)。這是因?yàn)镸IPs是由交聯(lián)劑和功能單體構(gòu)建的空穴組成，本身分布就不完全均勻。而且在本體聚合完成后，經(jīng)過研磨，產(chǎn)生了深淺不一的孔穴。吸附的初始階段，淺穴對模板分子的吸附較快，而當(dāng)淺穴吸附飽和時(shí)，就會對吸附產(chǎn)生一定的阻礙作用，導(dǎo)致吸附速率下降，但在8 h后基本完成了對酪胺的吸附［29］。

圖5 MIPs吸附動力學(xué)曲線Figure 5 Absorption dynamics curve of polymer

2.4 酪胺分子印跡聚合物的吸附特性

用Langmuir吸附等溫方程對體系中吸附量與平衡濃度的關(guān)系：

式中：

Q——單位質(zhì)量聚合物的吸附量，μmol／g；

Qmax——吸附平衡時(shí)聚合物的最大吸附量，μmol／g；

Ceq——平衡時(shí)溶液中酪胺的濃度，μmol／m L；

KD——平衡解離常數(shù)；

C——酪胺溶液的濃度，μmol／m L。

在0.7～1.5μmol／m L的濃度范圍內(nèi)，以 C—Q 作圖（圖6），曲線符合Langmuir吸附等溫曲線，印跡聚合物和非印跡聚合物的吸附量均與吸附液初始濃度的大小有關(guān)，都隨著酪胺溶液濃度的增大而增加。同時(shí)可以很明顯看出印跡聚合物的吸附量大于非印跡聚合物的吸附量，這表明組成成分相同的兩種聚合物的空間結(jié)構(gòu)是不同的，印跡聚合物中含有與模板分子酪胺功能基團(tuán)相匹配的空間位穴。用分子印跡中常采用的Scatchard模型來評價(jià)聚合物的結(jié)合特性，Scatchard方程式：

以Q／Ceq對Q作圖，MIPs對酪胺的結(jié)合曲線結(jié)果顯示為一條線性關(guān)系比較良好的直線：y＝－1.277x＋409.007（R2＝0.931 9），根據(jù)直線的斜率和截距，計(jì)算得出結(jié)合位點(diǎn)的平衡解離常數(shù)KD＝0.783μmol／m L，最大表觀吸附量Qmax＝320.29μmol／g；NIPs的擬合結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R2＝0.576 5，KD＝1.27μmol／m L，Qmax＝221.93μmol／g。據(jù)此判斷：在分子印跡聚合物中存在酪胺的特異性結(jié)合位點(diǎn)，而非印跡聚合物對酪胺的吸附特性不明顯。

圖6 MIPs和NIPs的吸附等溫線Figure 6 Absorption isotherms curves of MIPs and NIPs

2.5 酪胺分子印跡聚合物對酪胺的選擇性

選取與酪胺結(jié)構(gòu)類似的化合物作為分析物，用靜態(tài)吸附的方法測定印跡和非印跡聚合物對底物的吸附量Q，并計(jì)算分離因子α和印跡效率β，其中α為聚合物對酪胺的吸附量與聚合物對類似物的吸附量的比值，β為印跡聚合物的分離因子與非印跡聚合物的分離因子的比值。

由表1可知，印跡聚合物對酪胺的吸附量為124.04μmol／g，明顯高于對苯乙胺、組胺和亞精胺的吸附量，而非印跡聚合物對底物吸附量沒有明顯的區(qū)別。印跡聚合物對酪胺的分離因子α分別為1.20，1.41，1.54，可以看出印跡聚合物對酪胺的結(jié)構(gòu)類似物都有較好的吸附選擇性，但是對組胺、亞精胺的吸附選擇性比對苯乙胺的強(qiáng)，這是因?yàn)楸揭野返慕Y(jié)果與酪胺的結(jié)構(gòu)十分類似。

其印跡效率β為1.24，1.47，1.57，表明分子印跡聚合物對酪胺具有較好的選擇性吸附作用。

表1 印跡聚合物和非印跡聚合物分離因子α和印跡效率β的比較Table 1 Separation factorαand a imprinting efficiencyβ of MIPs and NIPs

3 結(jié)論

（1）以酪胺為模板分子，AM為功能單體，制備的印跡聚合物，對模板分子酪胺具有比較高的吸附性能，對組胺的吸附也體現(xiàn)出特異性識別的能力。

（2）通過紅外和紫外光譜分別對聚合物和預(yù)組裝體系進(jìn)行表征研究，結(jié)果說明在研究的濃度范圍內(nèi)，1個(gè)酪胺主要是與1個(gè)AM分子形成TYR－AM型復(fù)合物，K＝31.711×103L／mol。

（3）采用Scatchard模型評價(jià)了酪胺分子印跡聚合物的結(jié)合性。在試驗(yàn)研究的濃度范圍內(nèi)（0.7～1.5μmol／m L），聚合物對模板分子酪胺有單一的結(jié)合位點(diǎn)，和紫外預(yù)組裝的研究結(jié)果一致，擬合分析得出最大吸附量和平衡解離常數(shù)分別是Qmax＝248.33μmol／g和KD＝1.76μmol／m L，體現(xiàn)了較好的吸附效果。

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