展示在畢赤酵母表面稻米脂肪酶的性質(zhì)研究

朱 婧 謝 定 文 李 盛 敏 焦 玲 方 芳

ZHU Jing XIE Ding WEN Li SHENG Min JIAO LingFANG Fang

（長(zhǎng)沙理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114）

（College of Chemical and Biology，Changsha University of Science and Technology，Changsha，Hunan 410114，China）

脂肪酶是重要的工業(yè)酶制劑品種之一，可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于食品、化工、造紙等工業(yè)生產(chǎn)，目前主要產(chǎn)自微生物，中國(guó)長(zhǎng)期依賴(lài)于進(jìn)口，價(jià)格奇高［1］。稻谷糊粉層中含有大量的脂肪酶，在稻谷碾米時(shí)，由于細(xì)胞壁被破壞，脂肪酶與稻谷中的油脂接觸而迅速發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致米糠酸敗，因而稻米脂肪酶在糧食加工廠一直被當(dāng)作有害物質(zhì)，一般都要進(jìn)行鈍化或滅酶活處理后再進(jìn)行油脂提取和其它深加工［2］。20世紀(jì)末，有學(xué)者［3］發(fā)現(xiàn)稻米脂肪酶具有對(duì)中短鏈脂肪酯解及手性反應(yīng)催化活力高等特性，開(kāi)始進(jìn)行稻米脂肪酶的變廢為寶的研究，采取的方法是將米糠脫脂后提取分離得到脂肪酶后再研究利用。

近些年，酵母菌的應(yīng)用研究［4，5］越來(lái)越廣，而利用酵母菌展示技術(shù)更使得脂肪酶的開(kāi)發(fā)利用達(dá)到一個(gè)新的階段。酵母菌表面展示脂肪酶具有提高脂肪酶的產(chǎn)量，在使用過(guò)程中不用分離純化等優(yōu)點(diǎn)，但并不是所有脂肪酶均能展示成功且具酶活性［6，7］。畢赤酵母（Pichaia pastoris）是一種新型的真核表達(dá)系統(tǒng)，可以高效表達(dá)外源蛋白而細(xì)胞內(nèi)蛋白分泌極少，可以進(jìn)行高密度發(fā)酵，糖基化程度較低，同時(shí)具備了原核生物生長(zhǎng)速度快的優(yōu)點(diǎn)，以及真核細(xì)胞蛋白翻譯后的加工修飾功能，適用于大量表達(dá)有生物活性的外源蛋白［7，8］，但目前尚未見(jiàn)酵母成功展示稻米脂肪酶及其應(yīng)用的報(bào)道。本研究擬以畢赤酵母GS115作為表達(dá)宿主，異源表達(dá)稻米脂肪酶基因并初步研究了其酶學(xué)性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與設(shè)備

紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV2600型，上海舜宇恒平有限公司；

瓊脂糖凝膠電泳儀：DYCP－31DN型，北京天馳儀誠(chéng)生物科技有限公司；

凝膠成像儀：DOC 2000型，美國(guó)Bio－Red公司；

恒溫?fù)u床：NS－2102C型，天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

pPIC9K：美國(guó)Invitrogen公司；

畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115宿主菌：中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 工具酶、試劑與試劑盒

限制性內(nèi)切酶 EcoR I、Not I、Mlu I、Sac I，T4 DNA連接酶，DNA Marker等：大連寶生物科技有限公司（takara）；

質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒：德國(guó)Qiagen公司；

對(duì)硝基苯酚丁酸酯（p NPB）、PEG3350、LiCl：美國(guó)Sigma公司；

YPD培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基、YNB培養(yǎng)基：北京索萊寶生物科技有限公司；

其他為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 GCW14－RL基因 根據(jù)張軒薇等［8］的 GCW14序列以及Chuang等［9］的Rlipase序列，設(shè)計(jì)了 GCW14－RL融合基因序列，GCW14－RL基因的5’端添加了Eco RI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，3’端添加了Not I位點(diǎn)，GCW14和RL之間是Mlu I位點(diǎn)。Eco RI－GCW14－Mlu I－RL－Not I基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆到p UC57載體的多克隆位點(diǎn)上，命名為p UC57－GCW14－RL。

1.2 方法

1.2.1 pPIC9K－GCW14－RL載體的構(gòu)建 分別將p UC57－GCW14－RL和p PIC9K載體進(jìn)行Eco RI和 Not I雙酶切反應(yīng)，37℃水浴4 h之后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。采用膠回收試劑盒回收目的基因片斷GCW14－RL和pPIC9K載體片段。之后用T4 DNA Ligase進(jìn)行連接反應(yīng)，22℃過(guò)夜連接，之后轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有amp和kana抗性的LB固體培養(yǎng)基上37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取克隆進(jìn)行搖菌，質(zhì)粒抽提，并進(jìn)行Eco RI和Not I雙酶切反應(yīng)，之后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定［10］。將陽(yáng)性克隆命名為pPIC9K－GCW14－RL。

1.2.2 pPIC9K－GCW14－RL轉(zhuǎn)化到畢氏酵母GS115中

（1）煮沸1 m L鮭魚(yú)精DNA 5 min，迅速冰浴以制備單鏈擔(dān)體DNA；

（2）將pPIC9K－GCW14－Rl用Sac I內(nèi)切酶進(jìn)行線性化處理；

（3）將感受態(tài)酵母菌離心，以Tips去除殘余的LiCl溶液；

（4）對(duì)于每一個(gè)轉(zhuǎn)化，按以下順序加入：50%PEG3350，240μL；1 M LiCl，36μL；2 mg／m L 單 鏈 Salmon sperm DNA，25μL；5～10μg／50μL H2O 質(zhì)粒DNA，50μL。

（5）劇烈旋渦混勻直至沉淀菌體完全分布均勻（約1 min）；

（6）30℃水浴孵育30 min；

（7）42℃水浴熱休克20～25 min；

（8）6 000～8 000 r／min離心收集酵母菌體；

（9）重懸酵母于1 m L YPD培養(yǎng)基，30℃搖床孵育；

（10）1～4 h后，取25～100μL菌液鋪YD選擇性培養(yǎng)基平板（1.67%YNB＋2%dextrose＋1%瓊脂粉），于30℃培養(yǎng)2～3 d鑒定（將表達(dá)菌株和對(duì)照菌株在固體培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)）。因?yàn)镚S115是組氨酸缺陷型菌，YD培養(yǎng)基里面沒(méi)有組氨酸，因此GS115在YD培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，而pPIC9K帶組氨酸合成酶基因，只有成功轉(zhuǎn)化了pPIC9k－GCW14－RL的GS115菌才能在YD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

1.2.3 粗酶液制備 將畢赤酵母重組菌接種至YPD液體培養(yǎng)基中，30℃，250 r／min培養(yǎng)24 h，按1%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的BMGY培養(yǎng)基中，30℃，250 r／min培養(yǎng)5 d，每隔24 h加甲醇誘導(dǎo)，收集發(fā)酵菌體，用p H 8.0緩沖液洗滌3次，用少量緩沖液重懸，即得重組脂肪酶粗酶液。

1.2.4 脂肪酶活力測(cè)定 采用對(duì)硝基苯酚法測(cè)定脂肪酶的活力［8－11］，酶活力測(cè)定反應(yīng)體系總體積為10 m L，包括1 m L p NPB底物溶液（50 m M）以及9 m L 50 m M Tris—HCl（p H 8.0）；反 應(yīng) 體 系 混 勻 后 在 加 熱 振 蕩 器 中 35 ℃，800 r／min預(yù)熱5 min后，加入底物進(jìn)行反應(yīng)，10 min后立即12 000 r／min離心終止反應(yīng)；反應(yīng)結(jié)束后取上清液在405 nm處測(cè)定吸光度，只加底物跟緩沖液的樣品為空白，設(shè)3個(gè)平行，記錄A405值。一個(gè)酶活力單位為每分鐘水解所加底物生成1μmol p NP所需的酶量。

1.2.5 最適溫度 以p H 8.0的Tris—HCl緩沖液重懸菌體，在30，35，40，45，50，55，60，65，70℃分別保溫10 min后，以p NPB為底物，測(cè)定重組畢赤酵母在35℃下的水解活性。

1.2.6 熱穩(wěn)定性 以p H 8.0的Tris—HCl緩沖液重懸菌體，在50 ℃下保溫0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h后，以p NPB為底物，測(cè)定重組畢赤酵母在35℃下的水解活性。

1.2.7 最適p H 分別以p H 6.0，6.5，7.0的磷酸緩沖液，p H 7.5，8.0，8.5的 Tris—HCl緩沖液，p H 9.0，9.5，10.0的甘氨酸緩沖液洗滌菌體3次，并重懸，20℃保溫24 h，再用p H 8.0的Tris—HCl緩沖液洗滌3次，p NPB為底物，測(cè)定重組畢赤酵母在35℃下的水解活性。

1.2.8 固定化效果 將使用過(guò)后的酵母菌體用緩沖液洗滌3次并重懸，重復(fù)1.2.4的步驟測(cè)重組酵母菌的脂肪酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 pPIC9k－GCW14－RL載體的構(gòu)建結(jié)果

p UC57－GCW14－RL的 雙 酶 切 結(jié) 果 見(jiàn) 圖1（a）。回 收GCW14－RL與pPIC9k載體連接后的質(zhì)粒pPIC9k－GCW14－RL雙酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1（b），得到了預(yù)期大小的兩個(gè)片段。說(shuō)明成功將GCW14－RL亞克隆到了pPIC9k載體。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Figure 1 Agarose gel electrophoresis

2.2 pPIC9k－GCW14－RL載體轉(zhuǎn)化 GS115的結(jié)果

將pPIC9k－GCW14－RL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到GS115感受態(tài)的結(jié)果見(jiàn)圖2。由于GS115是組氨酸缺陷型菌，因此在YD培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，只有成功轉(zhuǎn)化了pPIC9K的GS115菌才能在YD培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

圖2 GS115在YD培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況Figure 2 Grouth of GS115 in YD medium

2.3 酵母表面展示稻米脂肪酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性

測(cè)定不同溫度下該重組脂肪酶的酶活，由圖3可知，該重組脂肪酶最適作用溫度為35℃，溫度30～45℃范圍內(nèi)都能保持80%以上的相對(duì)酶活力。比RL游離酶的最適溫度［10］低15℃。但該重組脂肪酶在50℃保溫1 h仍能保持97.3%的相對(duì)酶活性，在50℃保溫3 h后仍能保持80%以上相對(duì)的酶活力，證明該酶在50℃較高溫度下仍有較好的溫度穩(wěn)定性（圖4）。

圖3 酵母表面展示稻米脂肪酶的最適溫度Figure 3 Optimum of temperature on the activity of surface displayed RL

圖4 酵母表面展示稻米脂肪酶的熱穩(wěn)定性Figure 4 Thermal stablity of the activity of surface displayed RL

2.4 酵母表面展示稻米脂肪酶的最適p H

測(cè)定不同p H緩沖液條件下的酶活繪制曲線見(jiàn)圖5。該重組脂肪酶最適p H 為8.0，在p H 7.0到p H 10.0范圍內(nèi)都能保持80%以上的酶活力。與RL游離酶的最適p H［8］基本一致。但p H低于7.0時(shí)，酶活下降較快，p H為6.0時(shí)，酶活只有最高酶活的52%。

圖5 酵母表面展示稻米脂肪酶的最適p HFigure 5 Effect of p H on the activity of surface displayed RL

2.5 酵母表面展示脂肪酶的固定化效果

酶的操作穩(wěn)定性是固定化酶的重要特性之一，酵母展示稻米脂肪酶省去了酶的固定化操作卻具有可重復(fù)使用的固定化酶的特性。圖6顯示了酵母展示稻米脂肪酶的固定化效果，該重組脂肪酶在初次使用后，酶活性基本沒(méi)損失，重復(fù)使用5次之后仍具有80%以上的相對(duì)酶活力，活性降低的原因可能是因?yàn)槊看沃貜?fù)回收有少量的酵母展示脂肪酶的損失以及回收過(guò)程中多次沖洗導(dǎo)致活性降低以及反應(yīng)過(guò)程中酶部分熱失活所致。

圖6 酵母表面展示稻米脂肪酶的使用次數(shù)與相對(duì)活性Figure 6 Activity of surface displayed RL after repeated use times

3 結(jié)論

稻米脂肪酶對(duì)油脂具有很好的酯解活性，過(guò)去由于其難于分離提純而被廢棄。本試驗(yàn)將來(lái)自稻米脂肪酶（RL）的基因轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115宿主菌中，通過(guò)搖瓶發(fā)酵，測(cè)定其最適作用溫度為35～45℃，最適p H為8.0，與游離RL相差不大，而且酵母菌通過(guò)高密度發(fā)酵可獲得大量具有RL活性的菌體，不需要特別的分離提純和固定化處理，其重復(fù)使用5次依然可以保持80%以上的活性，這就為拓廣稻米脂肪酶的利用提供了依據(jù)。

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