苯扎氯銨對(duì)單克隆抗體親和層析填料的殺菌效果及其殘留量的檢測(cè)

阮乾坤，韓志剛，余軍陽(yáng)，杜伊達(dá)，楊大軍

單克隆抗體親和層析（monoclonal antibodies affinity chromatography，mAb AC）是一種高度特異性的用于分離、純化生物大分子的層析分離技術(shù)，但其填料在制備和使用的過(guò)程中易染菌，常規(guī)的殺菌劑，如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高濃度的鹽和有機(jī)溶劑容易對(duì)填料配基造成損傷或破壞［1］。本文經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，最終從眾多的殺菌劑中篩選出一種既能有效去除單克隆抗體親和層析填料中污染的細(xì)菌，又能保證單克隆抗體親和層析填料配基基本不被損傷或破壞的適宜的殺菌劑苯扎氯銨，并建立了苯扎氯銨在單克隆抗體親和層析填料中的低量殘留的有效檢測(cè)方法。雖然現(xiàn)有技術(shù)中常用的苯扎氯銨含量的檢測(cè)方法有多種，例如化學(xué)滴定法［2～4］、雙波長(zhǎng)紫外分光光度法［5］、毛細(xì)管電泳法（CE）［6］、高效液相色譜法（HPLC）［7］、示差分光光度法［8］、高效液 相色 譜 － 質(zhì)譜 法 （HPLC?MC）［9］、免疫法［10］、離子選擇電極法［11］和一、二階導(dǎo)數(shù)光譜法［12，13］等。 但在眾多方法中，化學(xué)滴定法和紫外分光光度法僅用于較高含量的測(cè)定，對(duì)于微量定量分析往往不夠，且達(dá)不到快速分析的要求；示差分光光度法往往需要衍生后才能測(cè)定，方法極為繁瑣費(fèi)時(shí)；HPLC?MS法分析成本高，目前常用于水體、土壤及食品中化合物的殘留分析；毛細(xì)管電泳法和一、二階導(dǎo)數(shù)光譜法既繁瑣，又不普及。因此，本文選擇最常用而高效的液相色譜法，利用其靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)檢測(cè)層析填料中殺菌劑苯扎氯銨的殘留。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

美國(guó) Waters公司高效液相色譜儀，包括WatersTM600 Controller型泵、WatersTM486型紫外檢測(cè)器和WatersTM2010數(shù)據(jù)處理機(jī)；采用美國(guó)Phenomenex公司 C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）。

乙腈購(gòu)自德國(guó)Merck公司；三乙胺（HPLC級(jí)）購(gòu)自美國(guó)Tedia公司；庚烷磺酸鈉購(gòu)自美國(guó)Fluka公司；苯扎氯銨購(gòu)自上海金山經(jīng)緯化工有限公司。

1.2 殺菌劑的篩選

1.2.1 初篩（菌懸液定量殺菌實(shí)驗(yàn)） 備選殺菌劑包括：甲醛、苯扎氯銨、疊氮鈉、硫柳汞鈉、鹽酸胍和紅霉素6種。取染菌的親和層析填料，用3 mL水充分浸泡后，4 000 r／min離心，取上清加入到90 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、160 r／min條件下?lián)u床培養(yǎng)18～24 h備用；分別取1 mL菌懸液，加入到129支裝有9 mL LB液體培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中，37℃、160 r／min條件下?lián)u床過(guò)夜培養(yǎng)。將甲醛、苯扎氯胺、疊氮鈉、硫柳汞鈉、鹽酸胍和紅霉素分別加入到上述各試管中，使每種殺菌劑形成3.2%、1.6%、0.8%、0.4%、0.2%、0.1%和0.05%共7個(gè)濃度，每個(gè)濃度做3個(gè)重復(fù)。將上述加有不同濃度殺菌劑的試管繼續(xù)37℃、160 r／min條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，觀察試管中菌懸液是否有澄清現(xiàn)象，并分別取0.1 mL菌液平鋪營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，對(duì)各濃度的各殺菌劑的每一平板的菌落計(jì)數(shù)結(jié)果取平均值，得到該濃度該殺菌劑的殺菌后平皿菌落數(shù)。另取剩余3支未加殺菌劑的試管中的培養(yǎng)液各0.1 mL平鋪營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，取平均值得殺菌前平皿菌落數(shù)。計(jì)算各濃度各殺菌劑的殺菌率。

1.2.2 復(fù)篩（親和層析凝膠蛋白吸附量測(cè)定）

根據(jù)初篩的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，綜合考慮殺菌效果、殺菌劑的毒性和殺菌劑在藥物制劑中的使用情況，初步選出殺菌效果較好的兩種殺菌劑甲醛和苯扎氯銨，通過(guò)考察它們對(duì)親和層析凝膠蛋白吸附量的影響，進(jìn)一步篩選出理想的殺菌劑。取3根裝有5mL單抗親和層析膠的層析柱（層析柱規(guī)格為10mm×100mm），首先用 25mmol／L， pH 7.0 的PBS緩沖液平衡3根層析柱5CV，然后分別用0.1%的甲醛和0.1%的苯扎氯銨平衡層析柱5CV，使單抗層析柱中充滿(mǎn)該兩種殺菌劑，并靜置2h；以不加任何殺菌劑處理的單抗層析柱作為空白對(duì)照。待分別用25mmol／L，pH 7.0的PBS緩沖液沖洗層析柱10CV，清除層析柱中的甲醛和苯扎氯銨后，再往層析柱中加入10 mg蛋白樣品；然后依次用 25mmol／L，pH 7.0的 PBST和 PBS緩沖液沖洗層析柱5CV；采用25mmol／L，pH 2.5的Gly緩沖液洗脫蛋白，并記錄洗脫體積，采用Lowry法測(cè)出蛋白質(zhì)濃度，最后計(jì)算出蛋白質(zhì)吸附量。與空白對(duì)照相比，蛋白吸附量越小，說(shuō)明該殺菌劑對(duì)單克隆抗體親和層析填料的破壞作用越大，不適合作為理想的殺菌劑。

1.3 殺菌劑苯扎氯銨的殘留檢測(cè)

1.3.1 色譜條件 流動(dòng)相A為0.2 mol／L庚烷磺酸鈉（含0.1%三乙胺，用磷酸調(diào)pH至3.0±0.1）；流動(dòng)相B為100%乙腈。流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B＝35∶65（V／V）。 色 譜 柱 采 用 Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速為 1.0 mL／min，柱溫25℃，進(jìn)樣體積40μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)液配制與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 精確配制濃度分別為 0.25 ng／mL、0.5 ng／mL、1.0 ng／mL、2.0 ng／mL和4.0 ng／mL的苯扎氯銨標(biāo)準(zhǔn)液。將系列標(biāo)準(zhǔn)液分別進(jìn)樣40μL，每個(gè)濃度重復(fù)3次，并以苯扎氯銨的峰面積對(duì)濃度作圖，考察其線(xiàn)性相關(guān)性，并確定檢出限。

1.3.3 實(shí)際樣品中苯扎氯銨的測(cè)定 用0.1%苯扎氯銨溶液處理親和層析凝膠柱，然后用PBS沖洗，沖洗至15 CV時(shí)，取樣，按照上述色譜條件，檢測(cè)樣品中苯扎氯銨的殘留量，樣品重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，考察本方法的精密度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Design?Export.V8.06響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析處理，確定庚烷磺酸鈉和三乙胺的最佳濃度比。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌劑的篩選

2.1.1 殺菌劑的殺菌效果比較 通過(guò)對(duì)甲醛、苯扎氯胺、疊氮鈉、硫柳汞鈉、鹽酸胍和紅霉素6種殺菌劑進(jìn)行初篩，不同濃度的殺菌劑殺菌效果如表1所示。在殺菌劑最低濃度為0.1%時(shí)，殺菌效果由強(qiáng)到弱依次為：鹽酸胍＝硫柳汞鈉＞苯扎氯銨＞甲醛＞紅霉素＞疊氮鈉。從安全實(shí)用角度看，硫柳汞毒性較大且易殘留，不宜作為藥品生產(chǎn)用殺菌劑；鹽酸胍會(huì)對(duì)親和層析凝膠造成嚴(yán)重?fù)p壞，也不適合作為殺菌劑；苯扎氯銨因常用在滴眼液中作為防腐劑，毒性低［8］，在本實(shí)驗(yàn)中殺菌效果比較理想，因此可選為備選殺菌劑；甲醛因在疫苗中常作為防腐劑，所以可選擇甲醛作為備選殺菌劑。

2.1.2 殺菌劑對(duì)親和層析凝膠蛋白吸附量的影響 分別用0.1%甲醛和0.1%苯扎氯銨處理親和層析凝膠，通過(guò)殺菌劑處理前后親和層析凝膠蛋白吸附量的變化，來(lái)進(jìn)一步篩選理想的殺菌劑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。親和層析凝膠在經(jīng)過(guò)0.1%甲醛處理后，蛋白吸附量降低了29.3%，初步分析，甲醛作為一種最小的含氧有機(jī)物，具有較高的反應(yīng)活性，與親和層析凝膠中的－OH（羥基）、－SH（巰基）、－NH2（氨基）發(fā)生分子親和加成反應(yīng)，使得親和層析凝膠中的自由基被甲醛交聯(lián)起來(lái)，部分失去了原來(lái)的生理功能，所以蛋白吸附量明顯降低；而親和層析凝膠在經(jīng)0.1%的苯扎氯銨處理后，蛋白吸附量?jī)H降低1.53%，這說(shuō)明0.1%的苯扎氯銨對(duì)其蛋白吸附量沒(méi)有明顯影響，因此，我們選擇0.1%苯扎氯銨作為最終的殺菌劑，來(lái)進(jìn)行下一步的研究。

表2 蛋白吸附量實(shí)驗(yàn)Table 2 Protein adsorption capacity test.

2.2 苯扎氯銨殘留量HPLC檢測(cè)方法的建立

2.2.1 流動(dòng)相的確定 流動(dòng)相為乙腈－庚烷磺酸鈉（含三乙胺）。其中，乙腈比例高于65%時(shí)，苯扎氯銨在色譜柱內(nèi)的保留時(shí)間過(guò)短；低于65%時(shí)，峰保留時(shí)間則太長(zhǎng)，且拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。從分離度和分析效率兩方面綜合考慮，將乙腈的比例定為65%。

流動(dòng)相中庚烷磺酸鈉溶液會(huì)對(duì)色譜柱有損傷，比較了 0.02 mol／L、0.04 mol／L、0.1 mol／L 和0.2 mol／L四種濃度下對(duì)苯扎氯銨的色譜分離效果，結(jié)果見(jiàn)圖1。庚烷磺酸鈉濃度為0.02 mol／L時(shí)，苯扎氯銨色譜峰嚴(yán)重拖尾，且對(duì)稱(chēng)性不好（圖1a），隨著濃度升高，保留時(shí)間逐漸拉長(zhǎng)，且峰形逐漸改善。在庚烷磺酸鈉溶液中添加三乙胺可以改善色譜分離效果，流動(dòng)相中乙腈的比例為65%（水相中pH 3.0）時(shí)，改變庚烷磺酸鈉中三乙胺的濃度，并采用Design?Export.V8.06響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果分見(jiàn)圖2。綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終將水相中庚烷磺酸鈉的最佳濃度定為0.2 mol／L，三乙胺的最佳濃度定為0.1 mol／L，此時(shí)苯扎氯銨色譜圖的對(duì)稱(chēng)性最高，色譜峰拖尾因子明顯降低。

圖1 庚烷磺酸鈉濃度對(duì)苯扎氯銨色譜保留行為的影響Fig.1 Effect of concentration of sodium heptanesulfonate on chromatogram retention behavior of benzalkonium chloride.

圖2 庚烷磺酸鈉和三乙胺濃度對(duì)色譜圖對(duì)稱(chēng)度的影響Fig.2 Effect of concentration of sodium heptanesulfonate and triethylamine on the symmetry of chromatogram.

2.2.2 流動(dòng)相pH的確定 苯扎氯銨為中性或弱堿性化合物，在水溶液中發(fā)生解離，其pKa約為7～9。要想保證待測(cè)樣品離子與離子對(duì)試劑完全形成中性離子對(duì)，必須使待測(cè)樣品在流動(dòng)相中完全電離，由于分子互換形式等量存在將導(dǎo)致峰展寬，所以要避免流動(dòng)相的pH等于待測(cè)樣品的pKa。當(dāng)pH與pKa相差一個(gè)單位時(shí)，分子的解離度為95%，相差兩個(gè)單位時(shí)，解離度為99%，要想使堿性化合物完全電離，其 pH＜pKa?2。磷酸的pKa約為2.2，因此pH為0.5～3.2時(shí)，磷酸鹽具有緩沖作用。鑒于反相色譜柱的耐酸性，本次實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相pH定為3.0。

2.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 苯扎氯銨在紫外波長(zhǎng)為210 nm和262 nm具有最大紫外吸收峰，但262 nm處吸收強(qiáng)度遠(yuǎn)弱于210 nm處，鑒于庚烷磺酸鈉與磷酸在210 nm處對(duì)苯扎氯銨紫外吸收無(wú)干擾，因此將檢測(cè)的吸收波長(zhǎng)定為210 nm。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和檢出限 常見(jiàn)苯扎氯銨主要有3種同系物（十二烷基二甲基芐基氯化銨、十四烷基二甲基芐基氯化銨和十六烷基二甲基芐基氯化銨）組成，由于原料的關(guān)系，本次實(shí)驗(yàn)樣品所用苯扎氯銨只含有十二烷基二甲基芐基氯化銨，且成分約占99.9%。在1.3.1所述色譜條件下，苯扎氯銨對(duì)應(yīng)的理論塔板數(shù)為8 803，色譜圖如圖3所示。以苯扎氯銨成分的峰面積對(duì)濃度作圖，在濃度為0.000 25～0.002 mg／mL范圍內(nèi)，線(xiàn)性方程為 y＝51 431x－3 650.5，R2＝0.999 8。 檢出限為0.000 25 mg／mL，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的檢出限（0.05～0.2 mg／mL）［14］相比，靈敏度提高了 200～800 倍。

圖3 苯扎氯銨液相色譜圖Fig.3 Chromatograms of benzalkonium chloride.

2.3 HPLC法對(duì)實(shí)際樣品中苯扎氯銨的測(cè)定

實(shí)際樣品中苯扎氯銨含量測(cè)定結(jié)果如表3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品檢測(cè)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.63%，精密度良好。與初始量相比，殘留量為0.435 ng／mL，遠(yuǎn)低于中國(guó)藥典要求的生物制品中苯扎氯銨殘留量0.05 mg／mL。

3 討論

藥品在純化過(guò)程中因親和層析柱的染菌，可能會(huì)帶來(lái)潛在的風(fēng)險(xiǎn)，本文在既保證能清除層析柱感染的細(xì)菌，又不使親和層析凝膠遭受殺菌劑破壞的前提下，首次篩選出一種理想的殺菌劑苯扎氯銨。0.1%的苯扎氯銨的對(duì)填料的實(shí)驗(yàn)殺菌率達(dá)到100%，并且對(duì)親和層析凝膠的蛋白吸附量沒(méi)有明顯影響；同時(shí)，苯扎氯銨還常用作滴眼液的防腐劑，具備用于生物制品生產(chǎn)所要求的安全性。隨即本文又建立了利用反相離子對(duì)高效液相色譜測(cè)定層析柱中苯扎氯銨殘留量的檢測(cè)方法。苯扎氯銨是離子型化合物，在純水－乙腈或純水－甲醇的流動(dòng)相中，保留時(shí)間短且峰型嚴(yán)重拖尾，因此采用反相離子對(duì)色譜，以庚烷磺酸鈉為離子對(duì)試劑，可以改善色譜峰的拖尾現(xiàn)象，使得檢測(cè)靈敏度有很大提高。本文所建立的方法采用C18柱，流動(dòng)相為乙腈－0.2mol／L庚烷磺酸鈉（含0.1%三乙胺，用磷酸調(diào)pH至3.0），210 nm紫外光檢測(cè)。檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，且表現(xiàn)出良好的重復(fù)性和精密度，適合作為清洗驗(yàn)證單克隆抗體親和層析中苯扎氯銨殘留量的檢測(cè)，在測(cè)定低樣品濃度時(shí)優(yōu)勢(shì)尤為明顯。

表3 實(shí)際樣品中苯扎氯銨含量測(cè)定結(jié)果Table 3 The determination results of benzalkonium chloride in practical samples.

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