假單胞菌中影響碳代謝的三種途徑及其調(diào)控機(jī)制

谷 偉，戰(zhàn)崳華，鄧志平，陸 偉

細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出一些復(fù)雜的機(jī)制來(lái)適應(yīng)環(huán)境的改變，碳代謝抑制就是其中之一。最早發(fā)現(xiàn)的碳代謝抑制現(xiàn)象是大腸桿菌中糖的分級(jí)吸收。碳代謝抑制是細(xì)菌重要的全局調(diào)控現(xiàn)象，當(dāng)細(xì)菌處于多種碳源同時(shí)存在的條件時(shí)，碳代謝抑制允許其優(yōu)先利用優(yōu)勢(shì)碳源，同時(shí)抑制劣勢(shì)碳源的利用。碳代謝抑制也決定著細(xì)菌生長(zhǎng)速度和碳源的選擇性吸收，能夠優(yōu)化細(xì)菌自身代謝，提高其在自然環(huán)境中的競(jìng)爭(zhēng)力。碳代謝抑制是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，在不同菌種中的分子機(jī)制各異。大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）中的碳代謝抑制機(jī)制是誘發(fā)排斥和cAMP依賴的轉(zhuǎn)錄，但這些機(jī)制在假單胞菌（Pseudomonas）中并非主要作用。

研究表明，假單胞菌中涉及三種碳代謝抑制的調(diào)控系統(tǒng)，分別是CbrAB／Crc系統(tǒng)、CyoABCDE系統(tǒng)及PTSNtr系統(tǒng)。這些系統(tǒng)同時(shí)存在，各自獨(dú)立同時(shí)系統(tǒng)間存在聯(lián)系。這些系統(tǒng)已經(jīng)在惡臭假單胞菌（P.putica）和銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）中得到深入研究。本文將對(duì)假單胞菌中的三種涉及碳代謝抑制的調(diào)控系統(tǒng)的機(jī)制進(jìn)行闡述。

1 Cbr AB／Crc系統(tǒng)

1.1 Cbr AB／Crc 系統(tǒng)的組成

CbrAB／Crc系統(tǒng)由維持細(xì)菌碳氮平衡的雙組份CbrA／CbrB、非編碼的sRNA以及全局調(diào)控子Crc組成。CbrA為感應(yīng)蛋白，具有磷酸激酶功能，可感知環(huán)境因子的信號(hào)，并相應(yīng)地催化自身以及CbrB的磷酸化。CbrB為效應(yīng)蛋白，它正調(diào)控sRNA，如 CrcZ和 CrcY sRNA。 Crc是 CbrAB／Crc系統(tǒng)中的重要組成元件，是一種全局調(diào)控子，其表達(dá)水平依據(jù)于生長(zhǎng)條件不同而變化，在后轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的表達(dá)［1，2］。 效應(yīng)蛋白調(diào)控的 sRNA與細(xì)胞中自由的Crc結(jié)合，從而調(diào)節(jié)Crc在細(xì)胞內(nèi)的水平，而Crc的水平直接影響到劣勢(shì)碳源代謝基因的表達(dá)。

1.2 Cbr AB／Crc 系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制

Crc最早發(fā)現(xiàn)于銅綠假單胞菌中，其調(diào)控機(jī)制已經(jīng)在惡臭假單胞菌OCT質(zhì)粒的烷烴代謝途徑中被揭示，即AlkS轉(zhuǎn)錄激活子誘導(dǎo)烷烴代謝基因的表達(dá)。當(dāng)烷烴存在時(shí)，Crc結(jié)合編碼AlkS蛋白的mRNA 5′末端，使其轉(zhuǎn)錄受到抑制，導(dǎo)致其不能完成翻譯，這就使得碳代謝抑制發(fā)生［3］。這種機(jī)制同樣存在于銅綠假單胞菌［4］和惡臭假單胞菌中［5］，銅綠假單胞菌中amiE mRNA和惡臭假單胞菌中的 benR mRNA的轉(zhuǎn)錄都受到 Crc的抑制。

當(dāng)Crc在細(xì)胞內(nèi)維持高水平時(shí)，Crc能夠結(jié)合目的基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前的Crc結(jié)合位點(diǎn)，從而阻止其轉(zhuǎn)錄表達(dá)來(lái)抑制碳源利用的作用，但當(dāng)sRNA在細(xì)胞內(nèi)高水平表達(dá)時(shí)，它們會(huì)結(jié)合自由的Crc，使得Crc的水平降低，劣勢(shì)碳源代謝基因的轉(zhuǎn)錄抑制被解除。目前發(fā)現(xiàn)的一些受Crc抑制的劣勢(shì)碳源代謝基因包括銅綠假單胞菌中涉及支鏈氨基酸吸收的基因bkd［6］，惡臭假單胞菌中涉及吸收苯甲酸、4?羥基苯甲酸和4?羥苯基丙酮酸的基因［7］，惡臭假單胞菌GPol中涉及烷烴降解的基因，惡臭假單胞菌pWW0質(zhì)粒中涉及甲苯降解的基因［8］以及假單胞菌 EST1001中涉及石碳酸降解的基因［9］。

CrcZ sRNA的發(fā)現(xiàn)將CbrA／CbrB雙組份的活性與Crc的功能串聯(lián)起來(lái)。它首先在銅綠假單胞菌中被發(fā)現(xiàn)［10］，全長(zhǎng) 407個(gè) nt，具有 6個(gè)特異的Crc識(shí)別位點(diǎn)，其表達(dá)受CbrA／CbrB雙組份的調(diào)控。當(dāng)銅綠假單胞菌在非優(yōu)勢(shì)碳源（如甘露醇或乙酰胺）中生長(zhǎng)時(shí)，CbrA／CbrB雙組份正調(diào)控crcZ基因并使其高效轉(zhuǎn)錄，高水平的CrcZ與自由的Crc結(jié)合，從而降低了其在細(xì)胞內(nèi)的水平，Crc對(duì)非優(yōu)勢(shì)碳源代謝基因表達(dá)的抑制被解除，如圖1所示［4］。 相反，當(dāng)琥珀酸作為碳源時(shí)，CbrA／CbrB雙組份的活性受到抑制，CrcZ在細(xì)胞內(nèi)的水平較低，從而導(dǎo)致Crc蛋白抑制目標(biāo)mRNA，非優(yōu)勢(shì)碳源不能被利用［4］。

圖1 降解物阻遏調(diào)控模型［4］Fig.1 Model of catabolite repression control［4］.

1.3 Cbr AB／Crc 系統(tǒng)的其他相關(guān)蛋白

在惡臭假單胞菌中，除CrcZ sRNA外，還存在著另一個(gè)類似的sRNA，命名為CrcY［10］。它們具有相似的序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)及功能。在碳代謝抑制條件下，CrcZ與CrcY的水平低于非抑制條件下的水平。單獨(dú)突變crcZ或crcY不會(huì)影響碳代謝抑制作用，因?yàn)楫?dāng)缺失crcZ或crcY后，剩下的另一個(gè)sRNA的表達(dá)量會(huì)大幅提高，來(lái)彌補(bǔ)缺失的sRNA，CrcZ與CrcY的功能互補(bǔ)使得缺失其中一個(gè)sRNA并不影響碳代謝抑制的發(fā)生［10］。但同時(shí)缺失crcZ與crcY后，碳代謝抑制作用明顯。在LB培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)菌處在對(duì)數(shù)期時(shí)，過(guò)表達(dá)CrcZ或CrcY會(huì)明顯減弱Crc依賴的碳代謝抑制，表明碳代謝抑制作用與sRNA關(guān)系緊密。當(dāng)優(yōu)勢(shì)碳源存在時(shí)，CrcZ與CrcY的水平較低，而自由的Crc水平較高，它們能夠結(jié)合目標(biāo)RNA，抑制其翻譯；相反，當(dāng)無(wú)優(yōu)勢(shì)碳源存在時(shí)，CrcZ與CrcY的水平明顯升高，從而抑制了Crc蛋白，無(wú)Crc蛋白結(jié)合抑制則目標(biāo)mRNA可與核糖體結(jié)合進(jìn)行正常翻譯。

1.4 Cbr AB／Crc 系統(tǒng)涉及的其他功能

除了對(duì)碳代謝途徑的控制，CbrAB／Crc信號(hào)傳導(dǎo)途徑還有許多功能。研究發(fā)現(xiàn)，在惡臭假單胞菌中，Crc調(diào)控一些氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因的表達(dá)，使得纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸等氨基酸吸收基因的表達(dá)受到抑制［11］。在完全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，Crc抑制OprB1孔道蛋白表達(dá)，阻礙葡萄糖的吸收，同時(shí)葡萄糖和果糖的內(nèi)膜運(yùn)輸?shù)鞍缀臀者@些糖所需的基因也被抑制。Crc的缺失導(dǎo)致葡萄糖酸和6?磷酸葡萄糖酸的吸收基因表達(dá)水平提高，這間接表明葡萄糖的吸收受Crc的抑制［11］。在銅綠假單胞菌中，蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示Crc抑制一些孔蛋白的合成，這解釋了crc突變株對(duì)特定抗生素敏感性增強(qiáng)的原因［12］。同時(shí)Crc也抑制藍(lán)色素和毒力因子綠膿菌素的產(chǎn)生，且Crc的缺失誘導(dǎo)編碼胞外多糖的基因簇過(guò)表達(dá)，影響了蹭行運(yùn)動(dòng)、III型分泌器和生物質(zhì)膜的形成［13］。在銅綠假單胞菌中，cbrB的突變導(dǎo)致生物質(zhì)膜減少［14］。在惡臭假單胞菌中，CBrAB雙組份系統(tǒng)不僅控制生長(zhǎng)底物的吸收，而且還控制抗逆性和生物質(zhì)膜的形成［15］。

2 CyoABCDE系統(tǒng)

2.1 CyoABCDE 系統(tǒng)的組成

CyoABCDE系統(tǒng)是由一些編碼電子鏈末端氧化酶的基因簇組成，在惡臭假單胞菌中，存在一個(gè)至少含有5個(gè)末端轉(zhuǎn)移酶的分支電子傳遞鏈，如圖2所示［16］，這個(gè)分支同樣存在于銅綠假單胞菌中。（應(yīng)把電子鏈上的主要氧化酶分別介紹一下，編碼基因，酶的特性，信號(hào)傳遞的順序等，至少要單獨(dú)介紹一下cyo）這些氧化酶在氧充足條件下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起著重要作用，而且每一個(gè)末端氧化酶通常對(duì)氧具有不同的親和力，故具有不同的氧化還原能力，且作為質(zhì)子泵具有不同的效率。

圖2 惡臭假單胞菌中的好氧呼吸鏈［16］Fig.2 Aerobic respiratory chain of Pseudomonas putida［16］.

2.2 CyoABCDE系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制

CyoABCDE系統(tǒng)通過(guò)假單胞菌好氧呼吸鏈中電子的轉(zhuǎn)移來(lái)調(diào)控基因的表達(dá)［17］。由乳酸、琥珀酸等電子供體通過(guò)好氧呼吸鏈將電子傳遞給細(xì)胞膜上的泛醌，由泛醌傳遞給Cyo末端氧化酶，再由Cyo通過(guò)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)調(diào)控非優(yōu)勢(shì)碳源代謝基因的表達(dá)，從而影響細(xì)菌對(duì)碳源的利用，但Cyo調(diào)控基因表達(dá)的信號(hào)尚不清楚。目前只知道在一些細(xì)菌中，雙組份系統(tǒng)能夠感應(yīng)來(lái)自電子傳遞鏈的信號(hào)，例如處在氧化還原狀態(tài)的醌或者是末端轉(zhuǎn)移酶中的電子流［18，19］。通過(guò)磷酸化轉(zhuǎn)錄調(diào)控子來(lái)產(chǎn)生感應(yīng)效應(yīng)，它能夠直接激活或抑制基因的表達(dá)。假單胞菌中很可能含有接受Cyo末端氧化酶信息的雙組份，通過(guò)這一過(guò)程實(shí)現(xiàn)信號(hào)傳遞進(jìn)而完成基因的調(diào)控，但是目前這種假設(shè)還沒(méi)有實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。

Cyo氧化酶基因的表達(dá)依據(jù)生長(zhǎng)條件改變而變化。當(dāng)細(xì)胞處于完全培養(yǎng)基對(duì)數(shù)期且氧充足條件時(shí)，它的表達(dá)量高；當(dāng)氧被限制或細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)，它的表達(dá)量降低［20，21］。 不僅如此，Cyo 氧化酶基因的表達(dá)也依賴于碳源。當(dāng)細(xì)菌在能夠誘導(dǎo)碳代謝抑制的碳源存在的培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)（如琥珀酸或氨基酸），它的表達(dá)量高于細(xì)胞在檸檬酸中水平，檸檬酸在惡臭假單胞菌中不能抑制烷烴代謝途徑［21］。Cyo不僅是電子傳遞鏈的末端氧化酶，而且還是全局調(diào)控系統(tǒng)的組成部分，它通過(guò)感應(yīng)和轉(zhuǎn)換電子傳遞鏈的活性的信號(hào)影響碳氮代謝，所以Cyo的水平可能與碳代謝抑制強(qiáng)度相關(guān)。

轉(zhuǎn)錄組分析表明，Cyo氧化酶的失活不僅影響烷烴或石碳酸降解基因的誘導(dǎo)表達(dá)，而且在豐富培養(yǎng)基中調(diào)控100多個(gè)基因的表達(dá)［20］，這也表明Cyo參與了全局調(diào)控過(guò)程。大部分被Cyo影響的是編碼質(zhì)子泵的基因，包括有機(jī)酸、芳香化合物的運(yùn)輸子，各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控子以及電子傳遞鏈的組成部分。Crc和Cyo的同源性很低，說(shuō)明它們處于各自獨(dú)立的全局調(diào)控系統(tǒng)。在惡臭假單胞菌中，Cyo氧化酶的失活影響了一些氨基酸、苯甲酸、果糖和各種有機(jī)酸作為碳源的利用以及氨基酸和尿素作為氮源的利用，這進(jìn)一步表明在假單胞菌中碳氮代謝調(diào)控中，Cyo末端氧化酶具有重要作用。

3 PTSNtr系統(tǒng)

3.1 PTSNtr系統(tǒng)的組成與功能

在假單胞菌中，存在一類不涉及糖類攝取的PTS分支系統(tǒng)，叫做PTSNtr系統(tǒng)。它由PtsP、PtsO及PtsN蛋白組成，這些蛋白分別同源于EINtr、NPr和 EIINtr蛋白［22］。

目前PTSNtr系統(tǒng)中各蛋白的研究還還處于起步階段。研究發(fā)現(xiàn)在一些革蘭氏陰性菌中，并非pstP基因位于rpoN操縱子內(nèi)部，而是pstN，且與rpoN 共轉(zhuǎn)錄［22，23］。 rpoN 基因編碼選擇性 δ 因子，它涉及碳源與氮源的代謝、鞭毛的合成和其它功能基因的表達(dá)［24］。PstN在PTSNtr系統(tǒng)中極為重要，PstN的磷酸化導(dǎo)致碳代謝抑制的產(chǎn)生。PtsN基因在不同菌中的缺失突變揭示了其在調(diào)控中的部分功能。例如在肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）中，缺失突變pstN的會(huì)導(dǎo)致nifH的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，nifH是一種涉及氮代謝的基因［25］。在銅綠假單胞菌中，缺失突變pstN后一些δ54依賴的基因不能被誘導(dǎo)［26］。大腸桿菌中，缺失突變pstN會(huì)影響其在含有劣勢(shì)氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但對(duì)含豐富氮源（谷氨酰胺或銨）的培養(yǎng)基影響不大［23］。缺失突變ptsN還會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌對(duì)亮氨酸的生長(zhǎng)抑制非常敏感［27］。這些缺失突變pstN后的現(xiàn)象都表明PTSNtr系統(tǒng)提供了一個(gè)細(xì)菌碳氮吸收調(diào)控連接。

3.2 PTSNtr系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制

PTSNtr系統(tǒng)通過(guò)系統(tǒng)內(nèi)的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)碳源的調(diào)控，磷酸基團(tuán)從PEP轉(zhuǎn)移到PtsP上，然后再磷酸化PtsO，最終將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到PtsN［22，28］。 與涉及糖類攝取的 PTS 系統(tǒng)不同的是，未磷酸化的PtsN也參與了一些代謝基因的調(diào)控，但具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。PTSNtr系統(tǒng)也沒(méi)有相當(dāng)于EIIBCA糖類轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的膜組分，它的磷酸化過(guò)程也不像糖類PTS系統(tǒng)那樣依賴于磷酸基團(tuán)的流動(dòng)。目前無(wú)證據(jù)表明PtsN能夠向底物轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)，PtsP／PtsO／PtsN蛋白功能可能只傳導(dǎo)信號(hào)，而磷酸化的PtsN提供調(diào)控信號(hào)，見(jiàn)圖 3［16］。

圖 3 PTSNtr系統(tǒng)［16］Fig.3 The PTSNtr system［16］.

近期研究也發(fā)現(xiàn)了一些能與PTSNtr系統(tǒng)中PtsN蛋白相互作用的新靶標(biāo)，這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了PTSNtr系統(tǒng)的調(diào)控范圍。比如，大腸桿菌中未磷酸化的PtsN能與親和力較低的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)子TrkA相互作用，抑制TrkA對(duì)鉀離子的吸收［27］。此外，未磷酸化的PtsN也能刺激編碼親和力較高的鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)子KdpFABC的基因表達(dá)［29］。這些發(fā)現(xiàn)表明PTSNtr系統(tǒng)可能在維持鉀離子體內(nèi)平衡方面發(fā)揮重要作用。PTSNtr系統(tǒng)還會(huì)影響一些響應(yīng)碳代謝抑制信號(hào)的基因的表達(dá)。在惡臭假單胞菌pWW0質(zhì)粒中，δ54依賴的Pu啟動(dòng)子涉及甲苯和二甲苯的吸收。當(dāng)甲苯或二甲苯存在時(shí)，效應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活子X(jué)ylR能夠誘導(dǎo)Pu啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。但當(dāng)同時(shí)存在甲苯和某些生理信號(hào)（如葡萄糖或琥珀酸）時(shí)，XylR對(duì)Pu啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)作用會(huì)被減弱，誘導(dǎo)作用將下調(diào)到一定范圍內(nèi)［30，31］。 然而，PtsN的失活會(huì)使葡萄糖或琥珀酸對(duì)Pu啟動(dòng)子的抑制減弱［32，33］，但不會(huì)影響葡萄糖的消耗。 這一現(xiàn)象表明減少糖類運(yùn)輸而能夠間接影響由PtsN的失活產(chǎn)生的抑制減弱。

磷酸化對(duì)PTSNtr系統(tǒng)的調(diào)控作用十分重要。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)ptsO基因失活后，無(wú)論培養(yǎng)環(huán)境中是否存在葡萄糖，Pu啟動(dòng)子的活性都被抑制。ptsO基因失活對(duì)Pu啟動(dòng)子影響與ptsN基因失活后相反［34］。這些都證明了磷酸化在PTSNtr系統(tǒng)調(diào)控中的重要性。ptsN與ptsO雙突變株的表型與rpoN突變株的表型相同，即葡萄糖對(duì)Pu的抑制減弱［35］。PtsO可以作為磷酸基團(tuán)的受體，因?yàn)槎c(diǎn)突變PtsO蛋白保守的His殘基會(huì)使其失活。所以磷酸化的PtsO可能需要葡萄糖對(duì)Pu調(diào)控的抑制。PtsN的活性也可能受 PtsO調(diào)控，因?yàn)镻tsO可以作為PtsN去磷酸化過(guò)程中磷酸基團(tuán)的受體。當(dāng)葡萄糖存在時(shí)，PtsO接受磷酸基團(tuán)，從而增加非磷酸化的PtsN的水平，這一過(guò)程可能是對(duì)Pu抑制的調(diào)控。而當(dāng)葡萄糖耗盡時(shí)，磷酸基團(tuán)會(huì)被轉(zhuǎn)移回PtsN［34］。目前對(duì)引起PtsN的磷酸化或去磷酸化的生理信號(hào)還不完全了解。惡臭假單胞菌中存在一些葡萄糖代謝的誘導(dǎo)物，如2?酮基?3?脫氧?6?磷酸葡萄糖（KDPG），它對(duì)于葡萄糖調(diào)控的代謝抑制很重要，推測(cè)其可能直接或間接地影響了 PtsN 的磷酸化［35，36］。

4 討論

在假單胞菌中，碳代謝抑制是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，涉及到 CbrAB／Crc、CyoABCDE及 PTSNtr三種系統(tǒng)。它們同時(shí)存在，相互獨(dú)立，可能也存在著聯(lián)系。研究表明惡臭假單胞菌中可能存在接受Cyo末端氧化酶信息的雙組份，而CbrAB／Crc系統(tǒng)中就包含維持細(xì)菌碳氮平衡的雙組份CbrA／CbrB，它們之間可能存在聯(lián)系來(lái)協(xié)同產(chǎn)生碳代謝抑制，但這種假設(shè)尚無(wú)實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。而PTSNtr系統(tǒng)與糖轉(zhuǎn)運(yùn)PTS系統(tǒng)之間存在交集，PTSNtr系統(tǒng)中非磷酸化的PtsN也參與基因的調(diào)控，這些可能把PTSNtr系統(tǒng)對(duì)代謝的調(diào)控與前兩個(gè)系統(tǒng)聯(lián)系起來(lái)。細(xì)胞內(nèi)可能存在三個(gè)系統(tǒng)同時(shí)發(fā)揮作用，協(xié)同調(diào)控碳代謝抑制。三個(gè)系統(tǒng)之間聯(lián)系對(duì)于碳代謝抑制的研究意義重大，對(duì)其進(jìn)行深入研究，會(huì)進(jìn)一步提高我們對(duì)碳代謝抑制調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

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