超聲波輔助提取山豆根中的黃酮和多糖工藝優(yōu)化

賴紅芳 黃秀香 陸俊宇

LAI Hong－fang HUANG Xiu－xiangLU Jun－yu

（河池學院化學與生命科學系，廣西 河池 546300）

（Department of Chemistry and Life Science，Hechi University，Hechi，Guangxi 546300，China）

山豆根為豆科槐屬植物越南槐 （Sophora tonkinensis Gapnep.）的干燥根及根莖［1］，別名廣豆根、苦豆根、山大豆根（主要分布在廣西地區(qū)石灰?guī)r山地）。其味極苦、性寒、有毒，具有清熱解毒、消腫利咽的功效，主治火毒蘊結、咽喉腫痛、齒齦腫痛等癥［2］。山豆根的化學成分主要有生物堿、多糖、酚類、黃酮類等化合物［3］。其中黃酮類具有抗自由基能力［4］、抗炎作用［5］、抗腫瘤活性［6，7］等。而山豆根多糖具有體外清除活性氧自由基作用，也可能具有保護肝臟作用［8］。

目前，鮮見對山豆根黃酮和多糖的研究，其中關于黃酮的報道［9］只是研究了提取方法，而未進行工藝條件的優(yōu)化；且多糖的提?。?0］采用的是傳統(tǒng)方法，提取率不高。超聲波法是利用低頻超聲條件下對中藥有效成分進行提取，并不改變藥物成分，并具有省時，操作簡單、快速等特點［11］。因此本研究擬采用超聲波進行輔助提取，結合正交試驗，分別對山豆根中的黃酮和多糖的提取工藝參數進行優(yōu)化，為山豆根開發(fā)的工業(yè)化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

山豆根：購于宜州中藥市場；

蘆?。篣V≥98%，批號：20110825，上海源葉生物科技有限公司；

濃硫酸、苯酚、檸檬酸、磷酸氫二鈉、無水乙醇、葡萄糖、氫氧化鈉溶液、硝酸鋁、亞硝酸鈉等：均為市售分析純。

1.1.2 主要儀器設備

紫外分光光度計：UV－2102PCS型，尤尼科儀器有限公司；

電子分析天平：AE240S型，梅特勒－托利多儀器有限公司；

p H計：PHS－3B型，上海精密科學儀器有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHB－Ⅲ型，鄭州長城科工貿易有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：SSY4型，北京泰克儀器有限公司；

超聲波儀：JY92－Ⅱ型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 山豆根的預處理 將烘干的山豆根粉碎后過20目篩，備用。取一部分用60%乙醇浸泡24 h進行脫脂。抽濾，在60℃恒溫烘干24 h后，備用。

1.2.2 山豆根中黃酮成分的提取

（1）提取方法：準確稱取山豆根粉末2 g，在一定料液比下加入一定濃度的乙醇提取劑，調節(jié)溶液p H，超聲波處理一定時間，抽濾，置于100 m L容量瓶中，用30%乙醇稀釋至刻度，得粗黃酮樣品液，備用。

（2）蘆丁標準曲線的制作：根據文獻［12］，得蘆丁質量濃度（mg／m L）與吸光度A 的關系方程為y＝14.346x＋0.002 2，r ＝0.999 7。

（3）山豆根黃酮含量的測定：準確吸取樣品液2 m L，置于25 m L刻度試管中，按標準曲線制作的方法進行操作，在波長為510 nm下測定吸光度。并按回歸方程計算樣品溶液中黃酮的濃度。按式（1）求出樣品中黃酮的含量。

式中：

R——黃酮含量，%；

C——由標準曲線求得的黃酮的濃度，mg／m L；

V1—— 稀釋體積，m L；

V2—— 樣品溶液的體積，m L；

M—— 樣品質量，g；

V3—— 吸取樣品溶液的體積，m L。

1.2.3 山豆根中多糖的提取

（1）提取方法：準確稱取2 g脫脂后的山豆根粉末，在一定料液比、溶液p H、提取時間、提取次數的條件下提取，抽濾，合并濾液，轉入250 m L容量瓶，定容。取2 m L上述溶液于50 m L容量瓶，定容，待測。

（2）葡萄糖標準曲線的制作：根據文獻［13］，得回歸方程：y ＝0.005 6x＋0.010 2，r＝0.999 2。

（3）換算因子的測定：根據文獻［14］，制備山豆根粗多糖后，經過測定及計算得到換算因子為f＝5.3。

（4）多糖含量的測定：吸取2.0 m L樣品液于25 m L比色管，按標準曲線方法進行顯色測定吸光度，并按回歸方程計算樣品溶液中葡萄糖的濃度，按式（2）計算樣品多糖含量。

式中：

Y——多糖提取率，%；

W——山豆根樣品的質量，g；

C—— 多糖中葡萄糖的質量濃度，μg／m L；

D——山豆根多糖的稀釋倍數；

f——換算因子。

2 結果與分析

2.1 山豆根中黃酮的提取工藝優(yōu)化結果

2.1.1 正交試驗結果與分析 通過前期單因素試驗結果，對影響山豆根黃酮提取率的不同因素進行了初步的篩選，確定以溶液p H、乙醇用量、提取時間、乙醇的濃度為考察因素，并進行正交試驗。以山豆根中黃酮含量為考察指標，采用四因素三水平L9（34）進行正交試驗，試驗因素水平見表1，結果見表2。

表1 L9（34）因素水平表Table 1 L9（34）factors level table

表2 正交試驗結果與分析Table 2 Orthogonal test results

由表2可知，4個因素對山豆根黃酮提取率的影響順序為A＞B＞D＞C，即料液比＞乙醇濃度＞提取時間＞p H值；根據極值大小確定山豆根黃酮的最佳提取工藝為A3B3C2D2，即料液比在1∶45（m∶V），乙醇濃度為100%，p H值為5，提取時間為70 min。

2.1.2 驗證實驗 準確稱取5份山豆根粉末2 g，按最佳條件提取，得待測液，按1.2.2標準曲線操作測定，計算出黃酮含量及 RSD。黃酮含量分別為8.59，8.61，8.61，8.61，8.60 mg／g，平均含量為8.60 mg／g，RSD為0.1% （n ＝5），說明工藝精密度高。

2.1.3 加樣回收試驗 準確吸取最佳條件下提取的樣品溶液2 m L于25 m L的比色皿中，平行5份，分別加入0.1 mg的蘆丁標準溶液，按標準曲線顯色，分別測其吸光度A值。根據回收率公式算出加樣回收率，結果見表3。由表3可知，平均回收率為95.52%，說明符合加標回收的要求。因此，分析結果是準確的。

表3 黃酮加樣回收率試驗Table 3 Flavonoids plus sample recovery experiment

2.2 山豆根中多糖的提取工藝優(yōu)化結果

2.2.1 正交試驗 通過前期單因素試驗結果，確定料液比、超聲時間、提取p H、提取次數為主要影響因素，設計四因素三水平試驗。試驗方案設計及結果見表4和表5。

表4 正交試驗因素水平表Table 4 Factor sand levels of orthogonal test

表5 正交試驗結果與分析Table 5 Results of orthogonal experiment

由表5可知，提取次數對山豆根多糖的提取結果影響最大，提取時間次之，提取p H影響最?。黄渥罴训奶崛l件為A2B1C3D3，即料液比為1∶20（m∶V），提取時間為30 min，提取p H＝4.50，提取次數3次。

2.2.2 驗證實驗 在最佳工藝條件下，進行5次重復性試驗，按1.2.3標準曲線測定并算出多糖含量及RSD。多糖提取率分別為6.06%，6.13%，6.06%，6.08%，6.07%，平均提取率為6.08%，RSD為2.83%（n＝5），說明該工藝穩(wěn)定。

2.2.3 加樣回收率試驗 準確吸取已知含糖量的樣品液5份，加入200μg葡萄糖，按標準曲線制作方法顯色，測定吸光度，根據公式算出樣品中多糖含量和加樣回收率。由表6可知，回收率為91.2%，說明山豆根多糖測定方法可行。

表6 回收試驗結果Table 6 Recovery experiment

3 結論

（1）超聲波法提取山豆根黃酮最佳工藝?？疾旖Y果為將2 g山豆根粉末，在p H＝5時用90 m L無水乙醇超聲提取70 min。在此條件下山豆根黃酮的得率為8.60 mg／g。

（2）超聲波提取山豆根多糖的最佳工藝條件為料液比1∶30（m∶V），提取時間20 min，提取p H 4.50，提取次數3次。在此條件下山豆根多糖的提取率最高，為6.08%。

（3）利用超聲波輔助法提取山豆根中黃酮并對其工藝進行優(yōu)化，為其工業(yè)化生產提供思路，而且最佳工藝條件下的提取率遠高于文獻［9］中的提取率。而在對多糖提取中，試驗結果比文獻［10］的水提醇沉法提取率幾乎提高1倍，大大提升了原料的利用率。同時超聲波具有操作簡單、快速、高效、污染低等特點，在工業(yè)化生產值得推廣。

1 國家藥典委員會.中國藥典 （一部）［M］.北京：化學工業(yè)出版社，2005.

2 丁佩蘭，郁韻秋，王鋼力，等.RP－HPLC法評價山豆根藥材質量［J］.復旦學報（醫(yī)學版），2004，31（2）：208～210.

3 鄧銀華，徐康平，章為，等.山豆根化學成分研究［J］.天然產物研究與開發(fā)，2005，17（2）：172～174.

4 杜士明，周本宏，楊光義.山豆根水提物抗炎作用研究［J］.中國藥房，2008，19（18）：1 371～1 372.

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10 尹龍萍，鄧毅，賈偉，等.山豆根粗多糖最優(yōu)化提取工藝研究［J］.中藥材，2007，30（3）：351～353.

11 賴紅芳；黃秀香；韋瑞松.超聲波法優(yōu)化一點紅多糖提取工藝［J］.食品科技，2012，37（1）：182～185.

12 李勝華，伍賢進，郁建平.超聲波提取魚腥草葉總黃酮優(yōu)化工藝研究［J］.食品科學，2006，27（12）：207～273.

13 黃瓊，丁玲.微波協(xié)同酶法提取金針菇多糖工藝的優(yōu)化［J］.食品與機械，2013，29（1）：128～130.

14 黃秀香，覃玥，黃艷梅.半枝蓮多糖提取工藝優(yōu)化［J］.食品與機械，2013，29（2）：128～129.