不同純化方法對花生多糖抗氧化活性的影響

劉光憲 馮健雄 王 輝

LIU Guang－xian 1，2 FENG Jian－xiong 1，2 WANG Hui 3

祝水蘭1，2 周巾英1，2 付曉記1，2

ZHU Shui－lan 1，2 ZHOU Jin－ying 1，2 FU Xiao－ji 1，2

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330200；2.國家花生加工技術(shù)研發(fā)分中心，江西 南昌 330200；3.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

（1.Jiangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanchang，Jiangxi 330200，China；2.National R＆D Subcenter for Peanut Processing，Nanchang，Jiangxi 330200，China；3.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330047，China）

冷榨制油技術(shù)因其加工條件溫和、蛋白變性程度低等優(yōu)點(diǎn)越來越受到消費(fèi)者及加工企業(yè)的關(guān)注［1］。冷榨花生餅是冷榨制油的主要副產(chǎn)物，近年來，冷榨花生餅的應(yīng)用主要有制備小分子肽、提取高純度蛋白粉、提取花生粗多糖及其功能特性的研究等［2－4］，但是多數(shù)研究是對花生中提取的粗多糖進(jìn)行功能特性的研究，在花生多糖純化及高純度花生多糖的性質(zhì)等領(lǐng)域的研究未見相關(guān)研究報(bào)道［5－7］。

人工合成的抗氧化劑如BHA和BHT等存在毒性和致癌性，其食用安全性備受關(guān)注，在食品加工中的應(yīng)用受到了限制。近年來，植物抗氧化劑如多糖、酚類、抗氧化肽、植酸、花色苷色素等因具有安全、抗氧化活性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而備受重視［8，9］，制備植物抗氧化劑，開展推廣應(yīng)用研究成為了熱點(diǎn)。

本研究擬采用不同純化方法分離純化花生多糖，并考察不同純度花生多糖的抗氧化活性，以期為花生多糖的分離純化及應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑

冷榨花生餅粕：山東德州宏鑫花生蛋白有限公司；

葡萄糖、3，5－二硝基水楊酸、DEAE－52 Cellulose、Sephadex G－200：分析純，美國Sigma公司；

耐高溫α－淀粉酶：酶活力2萬U／m L，美國Sigma公司；

糖化酶：酶活力10萬U／m L，美國Sigma公司；

透析袋：截留分子量3 500，美國Sigma公司；

疊氮化鈉、1，1－二苯基苦基苯肼（DPPH）、VC、鄰苯三酚、水楊酸、雙氧水、鹽酸、對氨基苯磺酸、七水合硫酸亞鐵、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸萘乙二胺：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器

紫外可見分光光度計(jì)：T6新世紀(jì)型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

臺式離心機(jī)：TDL－5－A型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

冷凍干燥機(jī)：LGJ－1型，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－4型，常州國華電器有限公司；梯度混合器：TH－500A型，上海琪特分析儀器有限公司；

恒流泵：BT1－100E型，上海琪特分析儀器有限公司；

電腦全自動部分收集器：DBS－100－LCD型，上海琪特分析儀器有限公司；

酸度計(jì)：Delta 320型，梅特勒－托利多國際股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多糖含量的測定 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚－硫酸法測定，經(jīng)分析，回歸方程為A ＝0.007 3x＋0.006 4（R2＝0.999 1）。 表明葡萄糖質(zhì)量在16～72μg范圍內(nèi)，吸光值與葡萄糖含量呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2 花生粗多糖的提取 參照文獻(xiàn)［5］的方法提取花生多糖，醇沉、離心、冷凍干燥后得花生粗多糖，經(jīng)測定花生多糖的含量為46.45%。

1.2.3 花生多糖的分離與純化

（1）分離：參照文獻(xiàn)［2］的方法采用雙酶水解解法進(jìn)行純化，花生多糖提取溶液先后經(jīng)耐高溫α－淀粉酶、糖化酶處理，滅酶后離心、過濾收集上清液，冷凍干燥得PPS－a組分，經(jīng)測定其花生多糖含量為78.12%。

（2）純化：花生多糖提取液采用木瓜蛋白酶－TCA法［5］脫蛋白后，經(jīng)DEAE－52纖維素離子交換柱層析純化，經(jīng)蒸餾水洗脫再用0.223 mol／L NaCl線性梯度洗脫，可得到兩個主要的多糖組分PPS－1和PPS－2，其花生多糖的含量分別為17.79%和66.93%。

1.2.4 花生多糖的抗氧化活性測定方法 以PPS－a、PPS－2為原料，以VC為對照，研究其抗氧化活性。

（1）羥自由基（·OH）的測定：參照文獻(xiàn)［10］。

（3）DPPH自由基清除活性的測定：參照文獻(xiàn)［12］。

（4）抗脂質(zhì)過氧化能力的測定：參照文獻(xiàn)［13～16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生多糖清除羥自由基（·OH）的能力

由圖1可知，兩種花生多糖提取物對·OH自由基均具有清除作用，在濃度為1.0～6.0 mg／m L時，抑制率隨濃度的增加而增強(qiáng)，經(jīng)測定清除羥自由基的半抑制濃度（IC50）分別是3.51，4.47 mg／m L，PPS－a對·OH 的清除活性高于PPS－2，并與VC（IC50＝4.49 mg／m L）處于同一水平。但在濃度大于5 mg／m L時，兩種多糖的活性均高于VC，PPS－a組分清除·OH自由基的能力大于PPS－2組分。

圖1 多糖溶液對·OH自由基的清除效果Figure 1 ·OH radical scavenging activity of the polysaccharides solutions

2.2 花生多糖清除超氧陰離子自由基（O·）的能力

由圖2可知，花生多糖提取物（PPS－a、PPS－2）對O·都具有清除作用，且抑制率隨著濃度的升高而增大，通過測定其消除超氧陰離子自由基的半抑制濃度（IC50）分別是3.02，7.31 mg／m L，表明多糖組分PPS－a清除O·的活性高于PPS－2組分。但與VC相比多糖的抗氧化活性較低。

圖2 多糖溶液對O的清除效果Figure 2 O·radical scavenging activity of the polysaccharides solutions

2.3 花生多糖清除DPPH·自由基的能力

由圖3可知，兩組花生多糖均具有清除DPPH·自由基的能力，清除活力隨花生多糖濃度的增加而增強(qiáng)，花生多糖PPS－a清除DPPH·能力高于多糖PPS－2組分。當(dāng)PPS－a的濃度為1.0 mg／mL時，其對DPPH·的清除率可達(dá)56.19%。經(jīng)測定，這兩個多糖組分的IC50值分別為0.856，1.697 mg／m L，PPS－a組分清除DPPH·自由基的能力大于PPS－2組分。與VC相比多糖的抗氧化活性較低。

圖3 多糖溶液對DPPH·的清除效果Figure 3 DPPH radical scavenging activity of the polysaccharides solutions

2.4 花生多糖還原力

由圖4可知，花生多糖（PPS－a、PPS－2）均具有還原能力，且隨多糖濃度的增大而增強(qiáng)，在濃度為8 mg／m L時，OD值分別為0.378和0.476，而VC的OD值為2.50，由此可看出花生多糖的還原能力約為VC的16%左右，PPS－a組分還原能力大于PPS－2組分。

圖4 花生多糖的還原力Figure 4 Reducing power of the polysaccharides solutions

2.5 花生多糖抗脂質(zhì)過氧化能力

由圖5可知，在濃度為0～10 mg／m L時，花生多糖（PPS－a、PPS－2）抗脂質(zhì)過氧化能力隨濃度的增加而增強(qiáng)，經(jīng)測定在10 mg／m L濃度時，抑制率分別為73.09%和56.86%，計(jì)算得出IC50分別為7.69，7.98 mg／m L，表明花生多糖PPS－a的抗脂質(zhì)過氧化能力較高，但都不如VC。

3 結(jié)論

采用雙酶（耐高溫α－淀粉酶、糖化酶）水解純化得到的花生多糖其抗氧化活性較DEAE－52纖維素柱層析法得到的花生多糖強(qiáng)；采用雙酶水解法純化多糖類物質(zhì)，通過酶的專一性、高效性能有效實(shí)現(xiàn)雜質(zhì)的分解去除，進(jìn)而提高多糖的純度；但兩種純化方法得到的花生多糖的結(jié)構(gòu)差異及其對抗氧化活性的影響仍需要進(jìn)一步研究。

圖5 多糖抗脂質(zhì)過氧化能力Figure 5 Anti－lipid peroxidation activity of the polysaccharides solutions

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