羅非魚內(nèi)臟蛋白酶解超濾產(chǎn)物的抗氧化活性研究

郭善廣 榮 婧 郭利平 楊 寧 蔣愛民

GUO Shan－guang 1 RONG Jing 1 GUO Li－ping 2 YANG Ning 3 JIANG Ai－min 1

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300；3.廣東省對(duì)外科技交流中心，廣東 廣州 510033）

（1.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642，China；2.Guangdong Light Industry College of Technology，Guangzhou，Guangdong 510300，China；3.Guangdong Science ＆ Technology Exchange Centre，Guangzhou，Guangdong 510033，China）

羅非魚屬鱸形目 （Perciformes）麗鯛科（Cichlidae）羅非魚屬（Tilapia），是原產(chǎn)于熱帶、亞熱帶的暖水性魚類。羅非魚肉質(zhì)厚、骨刺少，富含多種不飽和脂肪酸、易于加工保鮮，是公認(rèn)的優(yōu)質(zhì)蛋白來源。目前中國羅非魚產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的55%，是世界最大的羅非魚養(yǎng)殖生產(chǎn)國，羅非魚的年產(chǎn)量達(dá)到1×106t以上［1］。在羅非魚加工過程中，每年產(chǎn)生魚頭、魚皮、魚排以及內(nèi)臟等加工副產(chǎn)物大約2×105t［1］。目前部分副產(chǎn)物用來生產(chǎn)飼料，有的甚至被廢棄導(dǎo)致環(huán)境污染。副產(chǎn)物利用的廣度和深度仍然有待進(jìn)一步拓展。

本研究利用酶法降解羅非魚內(nèi)臟蛋白得到可溶性多肽，并采用超濾將水解產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)分離。擬應(yīng)用體外抗氧化試驗(yàn)對(duì)水解產(chǎn)物和超濾分級(jí)產(chǎn)物進(jìn)行評(píng)價(jià)，分析比較產(chǎn)物的還原能力、清除DPPH自由基能力、清除超氧陰離子能力及抑制卵黃磷脂氧化能力。旨在為羅非魚副產(chǎn)物的深度加工提供試驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，有利于提高副產(chǎn)物的利用效率、拓展其應(yīng)用領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

羅非魚內(nèi)臟：收集于廣州市天河區(qū)長湴農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，洗凈、絞碎后放于－20℃冰箱內(nèi)冷凍，試驗(yàn)時(shí)取出解凍即可使用；

胰蛋白酶：2 500 U／mg，廣州齊云生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

冷凍高速離心機(jī)：5804R型，德國艾本德儀器公司；

電子天平：PL203型，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；

數(shù)顯電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG－9073BS－III型，上海新苗醫(yī)療器械有限公司；

全溫振蕩器：QYC－2102C型，上海福馬實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：UV－1800型，島津儀器有限公司；

精密p H計(jì)：PHS－3C型，上海虹益儀器儀表有限公司；

凱式定氮儀：Kjeltec TM 8100型，福斯分析有限公司；

索式脂肪測(cè)定儀：2043型，福斯分析有限公司；

磁力攪拌器：78－1型，常州澳華儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－4型，常州澳華儀器有限公司；

循環(huán)水真空泵：SHZ－DIII型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

切向流超濾系統(tǒng)：Labscale小型，密理博中國有限公司。

1.3 羅非魚內(nèi)臟蛋白酶水解產(chǎn)物的制備

冷凍魚內(nèi)臟在室溫解凍，按比例加入適量的蒸餾水，用1 mol／L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)至所需的p H，加酶恒溫水浴水解。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定的羅非魚內(nèi)臟酶解產(chǎn)物制備工藝如下：起始p H 8.0，溫度50℃，料液比1∶3（m∶V），胰蛋白酶加酶量1 500 U／g·原料，水解時(shí)間4 h。水解結(jié)束后用沸水浴滅酶10 min，于3 000×g離心20 min，取中間澄清液層即蛋白酶解液檢測(cè)其抗氧化特性。蛋白酶解液的氮收率可以達(dá)到84.21%，水解度為49.13%。酶解液的上層為脂肪，可回收利用。

1.4 超濾分離羅非魚內(nèi)臟酶解液

酶解液在超濾分離之前，采用0.45μm的微孔濾膜過濾，真空抽濾去除酶解液中的固形物及雜質(zhì)，防止在超濾分離時(shí)堵塞膜組件，影響超濾分離。試驗(yàn)采用截留分子量為10，5 k Da 2個(gè)膜組件進(jìn)行分離，可以得到3種酶解產(chǎn)物，分子量分布分別為（I）＞10 k Da，（Ⅱ）5～10 kDa，（III）＜5 k Da。

1.5 水解度及氮收率的測(cè)定

（1）水解液中氨基態(tài)氮采用甲醛電位滴定法測(cè)定，水解度按式（1）計(jì)算：

式中：

DH—— 水解度，%；

AN——酶解液中游離氨基態(tài)氮的總量，g；

AN0——酶解前原料液游離氨基態(tài)氮的總量，g；

TN——羅非魚內(nèi)臟原料中總氮量，g。

（2）采用凱氏定氮法測(cè)定水解液的含氮量，并按式（2）計(jì)算氮收率：

式中：

NR—— 氮收率，%；

C1—— 水解液中總氮含量，g；

C2—— 原料總氮量，g。

1.6 產(chǎn)物抗氧化能力評(píng)價(jià)

酶解產(chǎn)物采用下述方法進(jìn)行測(cè)定，用VC作為陽性對(duì)照樣品。

1.6.1 還原力測(cè)定 采用 Oyaizu法［2］。添加樣品后，反應(yīng)體系在700 nm處吸光度的變化可以表明Fe2＋和Fe3＋之間的轉(zhuǎn)變，從而表征樣品的還原能力。吸光值越大，表示樣品還原能力越強(qiáng)［2］。

1.6.2 清除DPPH自由基能力測(cè)定 參照文獻(xiàn)［3］，取蒸餾水配制一系列濃度梯度的樣品溶液。以無水乙醇配制濃度為0.01 mmol／L的DPPH 溶液。取2.0 m L DPPH 溶液及2.0 m L樣品混合、振搖，暗處靜置30 min后，于517 nm處測(cè)吸光度A值；以不同濃度梯度的VC溶液作為陽性對(duì)照。

1.6.3 清除超氧陰離子能力測(cè)定 參照文獻(xiàn)［4］。

1.6.4 抑制卵黃磷脂氧化能力測(cè)定 參照文獻(xiàn)［5］。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅非魚內(nèi)臟蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性分析

2.1.1 酶解產(chǎn)物還原力分析 還原力檢測(cè)方法可以評(píng)價(jià)試樣是否具有良好的預(yù)防性抗氧化功能。樣品在700 nm處地吸光值越大，樣品的總還原力就越強(qiáng)［2］。選用具有較強(qiáng)抗氧化性的VC作為對(duì)照品，以此比較說明樣品還原能力的大小。圖1顯示了酶解產(chǎn)物及VC的還原力評(píng)價(jià)結(jié)果。

圖1 羅非魚內(nèi)臟酶解產(chǎn)物（以含氮量計(jì)）及VC的還原能力Figure 1 Reducing power of tilapia viscera hydrolysates（total nitrogen content）and of VC

由圖1可知，在擬合區(qū)間內(nèi)（試驗(yàn)樣品濃度范圍），各試樣的還原力與其濃度有明顯的正相關(guān)性；回歸分析也表明還原力與樣品濃度之間呈現(xiàn)線性關(guān)系。酶解產(chǎn)物和VC的還原力擬合方程分別為y ＝0.225 3x＋0.298 2（R2＝0.996 4），y ＝12.88x＋0.164 4（R2＝0.989 3）。 如果設(shè)定還原力的吸光值均為0.5，所需酶解產(chǎn)物氮濃度為0.896 mg／m L，而所需VC濃度僅為0.026 mg／m L，此時(shí)VC的還原力約為酶解產(chǎn)物的42.89倍。酶解產(chǎn)物的還原力雖然不如VC，但對(duì)還原Fe3＋還是具有一定的效果。酶解液的還原能力可能是由于所含肽中存在一些具有供氫能力的氨基酸殘基（如Tyr等）引起的。羅非魚內(nèi)臟蛋白肽鏈的斷裂增加了有效氫離子，能夠作為良好的電子供體打斷自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而達(dá)到抗氧化效果。

2.1.2 酶解產(chǎn)物清除 DPPH 自由基分析 DPPH（1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl）分子含有較為穩(wěn)定的自由基，試驗(yàn)中DPPH乙醇溶液為紫蘿蘭色，在517 nm下有高吸收值，結(jié)合試樣后，吸光值降低。吸光值越低表示試樣清除DPPH自由基的能力越強(qiáng)［6］。該方法目前廣泛應(yīng)用于抗氧化物質(zhì)的評(píng)價(jià)。

由圖2可知，酶解物和VC對(duì)DPPH自由基的清除作用均呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，隨濃度的增加，清除DPPH自由基的作用增強(qiáng)。酶解產(chǎn)物和VC對(duì)DPPH自由基的清除率擬合方程分別為y ＝150.85x＋3.44（R2＝0.999 1），y ＝8 174.9x－15.163（R2＝0.995 9）。酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH的清除作用的IC50值較VC大，為0.309 mg／m L，而VC對(duì)DPPH的清除作用的IC50值僅為0.008 mg／m L；酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基能力比VC要低，但其濃度達(dá)到0.6 mg／m L時(shí)，清除效率亦可達(dá)到94.67%。

圖2 羅非魚內(nèi)臟酶解產(chǎn)物（以含氮量計(jì)）及VC清除DPPH自由基能力Figure 2 DPPH radical scavenging activity of tilapia viscera hydrolysates（total nitrogen content）and of VC

2.1.3 酶解產(chǎn)物清除超氧陰離子能力分析 超氧陰離子是帶有一個(gè)未成對(duì)電子的自由基。超氧陰離子可存在于人體內(nèi)，它自身不發(fā)生化學(xué)變化而危害人體，但與羥自由基結(jié)合的產(chǎn)物會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞DNA損壞，破壞人體機(jī)能。目前多采用鄰苯三酚法［7］、黃嘌呤－黃嘌呤氧化酶法［8］、腎上腺素法［9］、NBT法［10］測(cè)定樣品的超氧陰離子自由基清除率，而鄰苯三酚自氧化法操作更為簡(jiǎn)便。

圖3和4顯示，添加酶解物和VC后，鄰苯三酚自氧化速率明顯低于空白對(duì)照組。而且隨著酶解物和VC濃度增高，自氧化速率降低。圖5更直接地表明酶解物和VC對(duì)超氧陰離子的清除作用均呈現(xiàn)出量效關(guān)系，隨濃度的增加，超氧陰離子的清除作用增強(qiáng)。酶解產(chǎn)物和VC清除超氧陰離子能力擬合方程分別為y ＝5.865x＋19.36（R2＝0.997 9），y ＝76.786x＋14.643（R2＝0.994 1）。酶解產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子清除作用的IC50值為5.224 mg／m L，而VC對(duì)超氧陰離子清除作用的IC50值為0.460 mg／m L。當(dāng)酶解產(chǎn)物的氮濃度為10 mg／m L時(shí)，對(duì)超氧陰離子的清除率可達(dá)77.07%。說明羅非魚內(nèi)臟蛋白酶酶解物具有較好的超氧陰離子自由基清除活性。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)羅非魚內(nèi)臟酶解產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子的清除能力不及對(duì)DPPH的清除能力。劉成梅等［11］也有類似發(fā)現(xiàn)，羅非魚魚皮多肽對(duì)DPPH自由基的抑制作用強(qiáng)于對(duì)超氧陰離子自由基的抑制作用。

圖3 酶解產(chǎn)物（以含氮量計(jì)）抑制鄰苯三酚自氧化速率Figure 3 Hydrolysates（total nitrogen content）inhibit pyrogallol autoxidation rate

圖4 VC抑制鄰苯三酚自氧化速率曲線Figure 4 VC inhibit pyrogallol autoxidation rate

圖5 酶解產(chǎn)物 （以含氮量計(jì)）及VC清除超氧陰離子能力Figure 5 Scavenging hydroxyl radical activities of hydrolysates（total nitrogen content）and of VC

2.1.4 酶解產(chǎn)物抑制卵黃磷脂氧化能力分析 在卵黃磷脂體系中，金屬離子誘導(dǎo)其中的磷脂、脂蛋白和脂肪酸等成分發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成丙二醛（MDA）。MDA在酸性加熱條件下，可與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成粉紅色的硫代巴比妥酸反應(yīng)物（TBARS），在532 nm處有特征吸收［12］。當(dāng)體系中有抗氧化物質(zhì)存在時(shí)，MDA生成量減少，終產(chǎn)物TBARS的產(chǎn)量也會(huì)減少，因此可通過吸光值的變化來評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度。

由圖6可知，酶解物和VC對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制作用均表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系，隨濃度的增加，脂質(zhì)過氧化的抑制作用增強(qiáng)，說明羅非魚內(nèi)臟水解產(chǎn)物有抑制脂質(zhì)過氧化的能力。酶解產(chǎn)物和VC抑制脂質(zhì)過氧化氧化能力擬合方程分別為y ＝ －8.623 3x2＋44.519x＋17.455（R2＝0.998 2），y ＝56.727x2－16.842x＋41.119（R2＝0.990 6）。 在擬合區(qū)間內(nèi)，酶解產(chǎn)物對(duì)脂質(zhì)過氧化的抑制能力與VC較為接近，其IC50值為0.882 mg／m L，對(duì)照VC對(duì)脂質(zhì)過氧化抑制作用的IC50值為0.571 mg／m L，當(dāng)酶解物產(chǎn)物的氮濃度1.5倍于VC溶液濃度時(shí)，二者對(duì)脂質(zhì)過氧化抑制作用相當(dāng)。說明羅非魚內(nèi)臟蛋白水解物具有良好的脂質(zhì)過氧化抑制活性。脂質(zhì)過氧化抑制能力高于斑鰶魚蛋白控制酶解物［13］的。該研究［13］顯示，酶解物蛋白含量為10 mg／m L時(shí)，脂質(zhì)過氧化抑制率為59.61%；本試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)酶解產(chǎn)物的氮濃度為1.57 mg／m L時(shí)，脂質(zhì)過氧化抑制率可達(dá)65.70%。

圖6 酶解產(chǎn)物（以氮含量計(jì)）及VC抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)能力Figure 6 Hydrolysates（total nitrogen content）and VC inhibit lipid peroxidation

2.2 超濾分級(jí)分離羅非魚內(nèi)臟蛋白酶解液

羅非魚內(nèi)臟蛋白酶解液經(jīng)超濾分離后得到不同分子量范圍的3個(gè)組分，按氮含量計(jì)算3個(gè)組分得率見圖7。

圖7 酶解產(chǎn)物超濾后組分分布圖（以氮含量計(jì)）Figure 7 Hydrolysate fraction after ultrafiltration（total nitrogen content）

由圖7可知，羅非魚內(nèi)臟蛋白經(jīng)胰酶水解后，酶解產(chǎn)物的分子量范圍比較寬泛，其中組分II最多，氮含量占到41.38%。加上組分III，分子量小于10 k Da的多肽占到79.97%。大分子的組分I含量最少，表明酶解比較充分。

2.2.1 超濾分離各組分清除DPPH能力分析 酶解產(chǎn)物的抗氧化分析表明，產(chǎn)物對(duì)DPPH產(chǎn)生的自由基比較敏感，IC50值最小，僅為0.309 mg／m L，水解產(chǎn)物DPPH自由基的清除容量高。因此以DPPH自由基清除率為指標(biāo)進(jìn)行超濾后酶解產(chǎn)物抗氧化能力的評(píng)價(jià)。圖8直觀地表明，超濾后，酶解產(chǎn)物各組分對(duì)DPPH自由基的清除率能力大小排序?yàn)榻M分III＞未超濾酶解液＞組分Ⅱ＞組分I。因此可以基本確認(rèn)組分III即分子量＜5 k Da的水解產(chǎn)物抗氧化能力最強(qiáng)。而未超濾酶解液中含有組分III，因此其自由基清除能力較高，而且高于其他兩種分離組分。

圖8 超濾分離各組分清除DPPH能力Figure 8 DPPH radical scavenging capacities of ultrafiltration fractions

采用SPSS軟件分析酶解物各組分對(duì)DPPH自由基的清除作用并擬合得出回歸方程見表1。由表1可知，隨著截留分子量的降低，各組分的IC50值呈降低趨勢(shì)，對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)。與未超濾的酶解產(chǎn)物相比，組分Ⅰ和組分Ⅱ的IC50值較大，其對(duì)DPPH自由基清除能力有所降低；組分III的IC50最小，僅為0.090 mg／m L，對(duì)DPPH自由基的清除能力比超濾前的酶解產(chǎn)物有顯著提高（P＜0.01），說明超濾可以富集酶解產(chǎn)物中的抗氧化活性肽。抗氧化肽分子量均比較小，氨基酸殘基的數(shù)目一般在20個(gè)以內(nèi)［14］。

2.2.2 超濾組分III的抗氧化能力 超濾可以將不同分子量大小的肽分級(jí)并富集，其抗氧化能力的表現(xiàn)更具有均一性，可以選擇性能更好的組分進(jìn)行應(yīng)用。組分III的抗氧化能力進(jìn)一步分析（見表2）表明，超濾后總的抗氧化能力有明顯的提高，但是對(duì)不同抗氧化體系提高的程度有所不同。相對(duì)于原液，組分III的清除超氧陰離子能力提高幅度明顯高于其他抗氧化體系，其IC50值由原液的5.224 mg／m L大幅降至0.714 mg／m L，與VC的IC50值處于同一個(gè)數(shù)量級(jí)。組分III的抗氧化活性高于未超濾的酶解產(chǎn)物，這可能是由于小分子肽暴露的活性基團(tuán)更多，與自由基和金屬離子接觸位點(diǎn)增多，一方面通過相互作用力抑制新的自由基的產(chǎn)生；另一方面作為氫供體可與已經(jīng)產(chǎn)生的自由基發(fā)生反應(yīng)，形成穩(wěn)定的產(chǎn)物，阻止了自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)［15］。最近有研究［14］表明，超濾后分子量小于5 kDa的蛋黃酶解產(chǎn)物有較強(qiáng)的抗氧化能力，其抗氧化能力與其分子量、磷含量及氨基酸組成有關(guān)，但具體的原因還有待于探討。超濾可以有效地將酶解產(chǎn)物分級(jí)，分級(jí)后產(chǎn)物的抗氧化能力更為均一，因此可以有效地集聚抗氧化活性較強(qiáng)的水解產(chǎn)物。

表1 超濾分離各組分清除DPPH能力的回歸分析Table 1 Regression analysis of DPPH radical scavenging capacities of ultrafiltration fractions

表2 組分III與酶解原液的抗氧化能力（IC 50值）的比較Table 2 Comparative analysis of antioxidant capacities of fraction III and enzymatic hydrolysate／（mg·m L－1）

3 結(jié)論

羅非魚內(nèi)臟經(jīng)過酶水解后得到可溶性的多肽，水解產(chǎn)物在還原力、清除DPPH自由基能力、清除超氧陰離子能力及抑制脂質(zhì)過氧化能力測(cè)試中顯示出良好的抗氧化能力。水解產(chǎn)物經(jīng)超濾分級(jí)后，3種組分與水解原液的清除DPPH自由基能力大小排序?yàn)榻M分III（＜5 kDa）＞原液＞組分II（5～10 k Da）＞組分I（＞10 k Da）。還原力、清除超氧陰離子能力及抑制脂質(zhì)過氧化氧化能力測(cè)試表明分子量＜5 kDa的組分III具有更強(qiáng)的抗氧化能力。本研究表明，羅非魚內(nèi)臟酶解產(chǎn)物經(jīng)超濾分離可以有效地分級(jí)濃縮抗氧化肽片段，也進(jìn)一步確證小分子肽的抗氧化活性更強(qiáng)，但其組成結(jié)構(gòu)及相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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