安全酵母Can dida glycerin ogen esis食品級(jí)甘油合成關(guān)鍵基因的研究

劉小紅 陳文強(qiáng) 諸葛斌 宗 紅

LIU Xiao－h(huán)ong 1，2 CHEN Wen－qiang 1 ZHU Ge－bin 2 ZONG Hong 2

陸信曜2 方慧英2 宋 健3

LU Xin－yao 2 FANG Hui－ying 2 SONG Jian 3

（1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723001；2.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

（1.School of Biological Science ＆ Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong，Shaanxi 723001，China；2.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education and the Research Centre of Industrial Microbiology，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214122，China；3.School of Chemical and Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214122 China）

甘油是一種應(yīng)用廣泛的食品安全添加劑，在醫(yī)藥、食品、個(gè)人護(hù)理和化工等1 700個(gè)行業(yè)［1］有著廣泛的應(yīng)用。在生理活性方面，甘油具有穩(wěn)定血糖和胰島素等作用；在果酒行業(yè)中，它可以分解果酒中的單寧，提升酒品的品質(zhì)、口感、去苦味；而在肉干、香腸、臘肉、果脯等產(chǎn)品制作中，可以鎖水，保濕，延長保質(zhì)期。甘油主要被用作甜味劑、乳化劑、保濕劑、煙草吸濕劑、溶劑［2，3］，另外還可用于改善食品外觀的添加劑［4］。

江南大學(xué)［5］采用微生物好氧發(fā)酵法生產(chǎn)甘油，已達(dá)到年產(chǎn)500 t食品級(jí)要求甘油的規(guī)模。而對食品級(jí)甘油的分子基因水平的研究，目前卻比較少。

產(chǎn)甘油假絲酵母是本研究室學(xué)者［6］篩選獲得的一株可以在高滲條件下，高產(chǎn)食品級(jí)甘油的安全工業(yè)酵母菌株，甘油的合成是葡萄糖首先經(jīng)磷酸化和醛縮酶的作用形成3－磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮，磷酸二羥丙酮在3－磷酸－甘油脫氫酶（CgGPD）的作用下，還原為3－磷酸甘油，此為甘油合成的第一步酶促反應(yīng)。3－磷酸－甘油在3－磷酸－甘油酯酶（ScGPP2）作用下脫磷酸根而形成甘油，此為甘油合成的最后一個(gè)酶促反應(yīng)。這兩步反應(yīng)中，第一步為甘油合成的關(guān)鍵步驟。而目前對其分子機(jī)制的研究較少，本研究通過基因工程改造手段，構(gòu)建甘油表達(dá)體系，進(jìn)一步提高食品級(jí)甘油產(chǎn)量及減少副產(chǎn)物，為降低下游食品級(jí)甘油的分離純化的難度提供有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

產(chǎn)甘油假絲酵母 （Can dida glycerinogenesis WL2002－5）、釀酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae W303－1A）、大腸桿菌 （Escherichia coli JM109）、p MD18－T vector、p E tac vector：江南大學(xué)工業(yè)微生物與生物反應(yīng)工程研究中心保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基配制

LB液體培養(yǎng)基：酵母膏5 g／L，蛋白胨10 g／L，NaCl 10 g／L，p H 7.0；

YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g／L，蛋白胨20 g／L，酵母膏10 g／L，瓊脂15～20 g／L，自然p H。

1.1.3 儀器與試劑

PCR儀：ALS1296型，美國BIO－RAD公司；

UVP凝膠成像系統(tǒng)：Alpha Innotech型，英國UVP公司；

p H計(jì)：Delta 320型，梅特勒－托利多集團(tuán)；

回旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜：HYL－B型，上海新星自動(dòng)化控制設(shè)備廠；

離心機(jī)：Allegra X－15R型，Beckman公司；

小型離心機(jī)：5415R型，Eppendorf公司；

分光光度計(jì)：UV1800型，優(yōu)尼柯儀器有限公司。

高效液相色譜儀：P680型，美國戴安公司。

各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、T4 Ligase：寶生物工程大連有限公司；

B型小量質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校罕本┎┐筇┛松锛夹g(shù)有限責(zé)任公司；

San Prep柱式DNA膠回收試劑盒：上海生工生物工程有限公司；

其余試劑：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中CgGPD 基因序列（登錄號(hào) EU186536.1）和ScGPP 2基因序列 （登錄號(hào) NC－001137.3）設(shè)計(jì)引物（表1）。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：CgGPD擴(kuò)增程序：預(yù)變性：94℃4 min；變性：94℃1 min，復(fù)性：59℃30 s，延伸：72℃70 s，共30個(gè)循環(huán)；保溫：72℃10 min。ScGPP 2擴(kuò)增程序：預(yù)變性：94℃4 min；變性：94℃1 min，復(fù)性：57℃30 s，延伸：72℃70 s，共30個(gè)循環(huán)；保溫：72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物Table 1 PCR primers used for amplification

1.2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE） 將重組菌株接種于10 m L LB液體培養(yǎng)基中，OD 值在0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5 m M，30℃誘導(dǎo)表達(dá)16 h。收集破碎細(xì)胞液，SDS－PAGE檢測表達(dá)情況。采用5%濃縮膠和12%分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳進(jìn)行蛋白分離，考馬斯亮藍(lán) R－250染色［7］。

1.2.3 CgGPD和ScGPP2粗酶液的制備 參照文獻(xiàn)［8］。將過夜誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于4℃以10 000 r／min離心10 min，菌體用細(xì)胞洗滌液（KH2PO410 m M，K2HPO410 m M，EDTA 2 m M，p H 7.5）洗滌兩遍，然后懸于10 m L破細(xì)胞緩沖液中 （KH2PO4100 m M，K2HPO4100 m M，DTT 1 m M，MgCl21 m M，EDTA 2 m M，p H 7.5）。采用超聲波法破壁細(xì)胞（功率300 W，工作1 s隔3 s，工作3 min），于4℃以10 000 r／min離心10 min，上清即為粗酶液。

1.2.4 酶活測定方法

（1）3－磷酸甘油脫氫酶酶活的測定［8］：GPD活性的檢測在檢測緩沖液（20 m M 咪唑－HCl，p H 7.0；1 m M DTT；1 m M MgCl2；0.67 m M DHAP；0.09 m M NADH 中進(jìn)行，酶促反應(yīng)溫度為30℃。無NADH氧化酶本底。在340 nm處測定30 s和90 s的吸光度。一個(gè)酶活單位定義為1 min消耗1μM NADH所需的酶量。

（2）3－磷酸甘油酯酶酶活測定：取稀釋好的濃度為1 mg／m L的粗酶液50μL，加入0.2 M DL－磷酸甘油10μL，1 M，p H 7.0咪唑10μL，0.25 M MgCl210μL，總體積為0.1 m L。在30℃的恒溫水浴中，反應(yīng)1 min后加入2 m L 5%的三氯乙酸終止反應(yīng)，離心，取上清液測其無機(jī)磷含量。在30℃，p H 7.0的條件下，每分鐘催化3－磷酸甘油產(chǎn)生1μM磷酸根所需要的酶量為1個(gè)酶單位。

1.2.5 蛋白含量測定 采用Bradford法［9］，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.2.6 產(chǎn)物檢測方法 Dionex高效液相色譜儀測定，色譜柱為 Amines HPX－87H（Bio－Rad）有機(jī)酸離子交換柱，柱溫60℃，流動(dòng)相為5 m M H2SO4，流速為0.6 m L／min。使用示差折光及紫外檢測器，使用外標(biāo)定量法定量［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)鍵酶基因CgGPD及ScGPP 2的克隆

以產(chǎn)甘油假絲酵母和釀酒酵母基因組DNA為模板，以P1，P2，P3，P4為引物，擴(kuò)增獲得大小分別約為1 100 bp和750 bp的Cg GPD和ScGPP 2片段，與Genbank公布的基因序列大?。? 167 bp和753 bp）一致［7］，結(jié)果見圖1。

圖1 CgGPD和ScGPP 2的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析Figure 1 Agarose gel electrophoresis of CgGPD and ScGPP 2 genes

2.2 關(guān)鍵基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

質(zhì)粒構(gòu)建過程如圖2所示，基因片段CgGPD純化后用EcoRⅠ，Hin dⅢ雙酶切，與相同酶切的載體p E tac連接，并轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞；克隆所得基因片段ScGPP 2，用SacⅠ，XhoⅠ 雙 酶 切， 與 酶 切 的p E tac 連 接； 以p E tac－ScGPP 2質(zhì)粒DNA為模板，擴(kuò)增兩端有Hin dⅢ 和XhoⅠ位點(diǎn)的tac－ScGPP 2目的片段，與雙酶切的pE tac－CgGPD 連接，完成雙啟動(dòng)子pE tac－CgGPD－tac－ScGPP2表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建。用含有kan抗性的平板篩選轉(zhuǎn)化子，同時(shí)，酶切驗(yàn)證，結(jié)果見圖3、4（a）。

2.3 關(guān)鍵基因表達(dá)及活性分析

重組菌株 E.coli （pE tac－Cg GPD－tac－ScGPP2）過夜誘導(dǎo)，收集菌體，超聲波破碎細(xì)胞，進(jìn)行SDS－PAGE，重組菌釋放出的目的條帶約42 k Da和27 kDa，與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的大小一致，確定為3－磷酸甘油脫氫酶和為3－磷酸甘油酯酶（見圖4（b））。

圖2 重組質(zhì)粒p E tac－CgGPD－tac－ScGPP 2的構(gòu)建Figure 2 Construction of the plasmid of p E tac－CgGPD －tac－ScGPP 2

圖3 p E tac－Cg GPD 和p E tac－ScGPP 2的酶切驗(yàn)證Figure 3 The enzymatic digestion of the plasmid p E tac－Cg GPD and p E tac－ScGPP2

圖4 p E tac－CgGPD－tac－ScGPP2的酶切驗(yàn)證及SDS－PAGE檢測Figure 4 The enzymatic digestion and SDS－PAGE analysis of the plasmid p E tac－Cg GPD－tac－ScGPP 2

經(jīng)酶活檢測（表2），在E.coli（p E tac－CgGPD）和E.coli（p E tac－CgGPD－tac－ScGPP 2）菌株中CgGPD 酶活分別為0.12 U／mg和0.06 U／mg。在E.coli（p E tac－ScGPP 2）和E.coli（p E tac－CgGPD－tac－ScGPP 2）菌株中ScGPP 2酶活分別是0.03 U／mg和0.01 U／mg。3－磷酸甘油脫氫酶是甘油合成過程中的關(guān)鍵酶基因，其酶活的高低直接影響著甘油的合成，本研究中Cg GPD具有相對較高的酶活，對甘油合成有著重要作用。SDS－PAGE及酶活性分析結(jié)果表明，甘油合成基因在大腸桿菌中進(jìn)行了功能性表達(dá)。

2.4 關(guān)鍵基因表達(dá)菌株的發(fā)酵

E.coli（p E tac－CgGPD－tac－ScGPP2）菌株經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，在1%，2%，3%，4%葡萄糖濃度下，經(jīng)48 h后，其胞外甘油分別累積到1.35，1.87，2.52，2.25 g／L，而對照野生菌株中卻沒有檢測到甘油（圖5），表明CgGPD在甘油合成過程中起關(guān)鍵作用，過表達(dá)CgGPD有助于甘油合成。與劉艷青等［8］構(gòu)建的串聯(lián)表達(dá)載體合成1.56 g／L甘油相比，本研究所采用的雙啟動(dòng)子串聯(lián)表達(dá)，更有利于甘油合成。

表2 酶活及甘油濃度測定Table 2 The specific activity of CgGPD and ScGPP2

圖5 不同葡萄糖濃度下甘油含量Figure 5 Concentration of glycerol under difference conditions

3 結(jié)論

本中心已對產(chǎn)甘油假絲酵母甘油合成的高滲調(diào)控機(jī)制（HOG途徑）做了很多的研究［11，12］，這些研究對高產(chǎn)食品級(jí)甘油具有至關(guān)重要的理論指導(dǎo)作用。本課題為了進(jìn)一步提高食品級(jí)產(chǎn)量及減少副產(chǎn)物，減輕下游分離純化的壓力，研究其甘油合成機(jī)制中甘油合成關(guān)鍵基因，克隆獲得關(guān)鍵酶基因3－磷酸－甘油脫氫酶基因（CgGPD），并在大腸桿菌中通過tac啟動(dòng)子串聯(lián)表達(dá)來自釀酒酵母的3－磷酸 －甘油酯酶基因（ScGPP 2）。在搖瓶發(fā)酵過程中可合成2.52 g／L的甘油。相比之前的研究［7］，食品級(jí)甘油合成量提高了1倍，結(jié)果說明通過tac啟動(dòng)子串聯(lián)表達(dá)CgGPD基因，可以獲得更高的甘油含量。此研究表明3－磷酸 －甘油脫氫酶（CgGPD）在甘油合成過程中起關(guān)鍵作用，過表達(dá)CgGPD有助于甘油合成。

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