新型介孔二氧化硅納米微球/羥基磷灰石/生物玻璃復(fù)合生物涂層的體外理化特性*

鄧元 郭翔*

論著·實(shí)驗(yàn)研究

新型介孔二氧化硅納米微球/羥基磷灰石/生物玻璃復(fù)合生物涂層的體外理化特性*

鄧元 郭翔*

目的本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)制備了介孔硅納米微球(mesoporous silic ananoparticulate,MSN)/羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)/生物玻璃 (bioactive glass,BG)復(fù)合生物涂層。并對(duì)其加載唑來(lái)膦酸 (Zoledronic acid,ZOL)后的體外藥物釋放特性進(jìn)行了研究。方法通過(guò)掃描電鏡、透射電鏡及能譜儀等方法觀察H/M涂層表征。通過(guò)高效液相色譜法進(jìn)行HA/MSN/BG、HA/MSN及HA生物涂層體外ZOL加載及釋放的比較。結(jié)果通過(guò)掃描電鏡觀察HA/MSN涂層，發(fā)現(xiàn)其具有二氧化硅微球組成的多孔結(jié)構(gòu)。體外藥物實(shí)驗(yàn)中H/M比HA載藥量大更且與初始藥物濃度相關(guān)，并具有藥物緩釋的特性，涂布BG后緩釋效應(yīng)更加明顯。結(jié)論 H/M/B因其具有載藥量大及藥物緩釋特性，為生物涂層內(nèi)固定物在骨折愈合上的應(yīng)用提供了新技術(shù)。

二氧化硅納米微球；生物玻璃；唑來(lái)膦酸；理化特性；藥物釋放

生物涂層覆蓋技術(shù)給內(nèi)固定后骨折不愈合帶來(lái)了新的機(jī)遇。近十年來(lái)，在人工髖關(guān)節(jié)假體涂層成功應(yīng)用的基礎(chǔ)上，各種具有良好生物相容性并能夠攜帶生長(zhǎng)因子(IGF,TGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)等具有刺激骨愈合的活性物質(zhì)的內(nèi)固定涂層逐漸被應(yīng)用于長(zhǎng)骨內(nèi)固定物表面。

已有研究表明唑來(lái)膦酸 (Zoledronic acid,ZOL)作為一種分子量小、價(jià)格經(jīng)濟(jì)且易于獲得的藥物局部作用于骨折部位時(shí)可在產(chǎn)生很少副作用的情況下發(fā)揮其抑制破骨細(xì)胞的功能，從而促進(jìn)骨折的愈合。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)一種新的生物活性的介孔材料-介孔硅納米微球 (mesoporous silica nanoparticulate,MSN)與傳統(tǒng)無(wú)機(jī)及有機(jī)高分子藥物載體材料相比具有藥物裝載量大、緩釋釋放附著牢固且無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，為了增強(qiáng)器緩釋釋放的特性，從而對(duì)破骨細(xì)胞達(dá)到有效抑制，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種能加載ZOL的HA/MSN/BG新型復(fù)合生物涂層。本實(shí)驗(yàn)對(duì)新型介孔二氧化硅微球/羥基磷灰石/生物玻璃復(fù)合生物涂層 (HA/MSN/BG)的表征及體外藥物釋放特性進(jìn)行了研究，以期為該生物涂層的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 方法及材料

1.1 材料

用直徑2.0mm、長(zhǎng)230mm的不銹鋼Kirschner(上海浦東金環(huán)醫(yī)藥公司)作為涂層載體。以APS系統(tǒng)(瑞士Sulzer Metco公司)利用表1中最優(yōu)化的噴霧參數(shù)對(duì)載體用顆粒大小15～50 m HA粉末 (瑞士Sulzer Metco公司)進(jìn)行涂布，得到HA涂布的不銹鋼Kirschner樣品(HA-w)。利用掃描電鏡、能譜儀及小角XRD衍射和透射電子顯微鏡(TEM)，對(duì)已制備的H/M復(fù)合涂層樣品進(jìn)行表征分析。

表1 等離子噴涂參數(shù)

1.2 制備MSNs/HA復(fù)合涂層

將涂有HA的不銹鋼kirschner剪成0.5cm長(zhǎng)的小段浸泡在5ml(1mol/L)HCl中1分鐘并用去離子水洗滌后備用。用10段處理過(guò)的樣品放入16ml乙醇溶液中，并加入0.2ml (質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%)的十六烷基三甲基溴化銨 (CTAB)溶液。隨后加入4ml去離子水水及0.5ml氫氧化鈉溶液 (0.1mol/L)并輕輕攪拌，再向混合溶液中逐滴加入2ml乙醇稀釋的正硅酸乙酯(TEOS)硅前體。整個(gè)反應(yīng)在37℃下維持24小時(shí)后將樣品取出，用去離子水洗滌并干燥。最后以用馬弗爐以2℃/min的升溫速度對(duì)樣品進(jìn)行煅燒4小時(shí)，除去涂層中的表面活性劑，制備成HA/MSNs復(fù)合涂層樣品 (H/M-w)。

1.3 MSNs/HA復(fù)合涂層表征研究

通過(guò)用掃描電子顯微鏡 (SEM,FEIQuanta450)觀察樣品的表面形態(tài)學(xué)特征來(lái)確定整個(gè)涂布反應(yīng)不同階段的樣品表征。不同涂層的復(fù)合物樣本用能譜儀 (EDS)進(jìn)行檢驗(yàn)。用透射電鏡 (TEM,JEOL2010)觀察和分析從H/M-w上輕刮下來(lái)的HA/MSN復(fù)合涂層粉末。通過(guò)對(duì)HA/MSN與HA兩種涂層樣本進(jìn)行N2吸附/解離實(shí)驗(yàn)，用付利葉紅外變換光譜(FI-IR)分析記錄 N2濃度并繪制等溫曲線(xiàn)，進(jìn)一步對(duì) HA/ MSN涂層粉末的表征進(jìn)行測(cè)量分析。

1.4 唑來(lái)膦酸裝載及體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)

將唑來(lái)膦酸原藥 (江蘇正大天晴藥業(yè)有限公司)溶解于超純水中形成 5、10、20 M/ml三種濃度的混合溶液。將HA-w及 H/M-w分別浸泡在10ml各濃度的混合液中3天(共取3組含不同濃度梯度的溶液，一組＝三種濃度溶液中各放4段0.5cm的HA-w樣品，另一組溶液中各放4段0.5cm的H/M-w樣品，最后一組溶液仍各放4段0.5cm的H/M-w樣品)，以獲得唑來(lái)膦酸藥物裝載。剩余溶液保留并進(jìn)行進(jìn)一步檢查。采用溶膠-凝膠工藝制備生物玻璃溶膠[1]。把一定比例的正硅酸四乙酯 (TEOS)置入燒杯，加入無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)龜嚢杈鶆蚝?，依次加入磷酸三乙?TPE)、四水硝酸鈣 [Ca(NO3)2·4H2O]、去離子水和硝酸，繼續(xù)攪拌1小時(shí)后，把配好的均勻溶液置放于室溫環(huán)境下陳化2天，通過(guò)水解縮聚反應(yīng)配制成適于涂層的組成范圍為(mol%)：CaO 16～21，P2O54，SiO275～80的溶膠溶液。將在最后一組溶液中加載了ZOL的H/M涂層樣本浸入溶液中10秒鐘，然后迅速拿出、甩干殘留溶液，并在37℃下，利用循環(huán)真空脫氣法使該復(fù)合物進(jìn)一步穩(wěn)定。最終獲得ZOL加載的的HA/ MSN/BG的復(fù)合涂層樣本。

取0.5cmHA-w、H/M-w及H/M/B-w樣品放入3ml37℃且濃度0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液 (PBS)中，在事先設(shè)定好的時(shí)間節(jié)點(diǎn)吸取少量緩沖液，并用預(yù)熱過(guò)的新鮮的緩沖液進(jìn)行補(bǔ)充，經(jīng)樣品前處理后通過(guò)高效液相色譜儀 (HPLC, Agilent1260)進(jìn)行檢測(cè)(共用不同涂層的各4段0.5cm樣品實(shí)驗(yàn)4次，數(shù)據(jù)求平均值)。技術(shù)參數(shù)為C18裝樣柱(200mm ×4.6mm,5 m)，流率1ml/min,215nm紫外線(xiàn)檢測(cè)。流動(dòng)相為用磷酸滴定的 PH為6.8的25%氰化甲烷及75%緩沖液(8mmol/LNa4P2O3,20mmol/L四丁基銨氫氧化物，TBHA)的混合液。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)及顯微結(jié)構(gòu)特征

圖1 H/M-w涂布過(guò)程中不同階段樣品的表征的ESM圖像。（a）裸鋼絲表面；（b）HA等離子噴涂后的鋼絲表面由于覆蓋了致密的微粒而變得粗糙；（c）稀HCL預(yù)處理后的HA-w表面出現(xiàn)了易于MSN附著的缺損及孔洞；（d）H/M-w表面大量MSN已逾期的效果彼此交聯(lián)并穩(wěn)固的結(jié)合于事先建立好的缺損及孔洞中

圖2 (a)刮下來(lái)的H/M-w涂層粉末的TEM圖像；(b)放大的納米微球TEM圖像顯示了其具有的無(wú)序及不均勻的微孔結(jié)構(gòu)，相對(duì)應(yīng)面積的EDS光譜分析；(c)黃色框內(nèi)，EDS檢測(cè)的結(jié)果顯示涂層粉末具有典型的Ca，P，Si和O峰提示谷曾物粉末成分為HA/MSN；(d)紅色框內(nèi)，EDS光譜顯示了納米微球?yàn)榧僑i-O組成

SEM記錄了HA/MSN涂布過(guò)程中不同階段樣品的表征(圖1)。為了獲得更多的微觀結(jié)構(gòu)信息，我們將最終的生物涂層刮下來(lái)并利用透射電鏡 (TEM)觀察。(圖2)檢測(cè)結(jié)果顯示涂層物粉末是一種不規(guī)則的晶體化HA微粒及硅納米微球的混合物。對(duì)兩種涂層樣品進(jìn)行N2吸附/解離實(shí)驗(yàn)，利用FI-IR檢測(cè)N2的濃度而繪制的等溫曲線(xiàn)也顯示了一致的結(jié)果(圖3，彩圖見(jiàn)插頁(yè))。我們通過(guò)N2吸附/解離等溫線(xiàn)對(duì)H/M-w涂層粉末的物理性質(zhì)及微球的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了記錄和分析并與HA-w涂層粉末進(jìn)行了比較。(圖 3)通過(guò)曲線(xiàn)解離支計(jì)算HA/MSN涂層樣本中納米微球顆粒的孔徑大概在2.5nm左右，測(cè)得的BET比表面積為97m2/g。

圖3 H/M-w涂層粉末(紅)和HA-w涂層粉末(黑)的N2吸附/解離等溫線(xiàn)及H/M-w涂層粉末微孔孔徑分布(嵌入圖)

2.2 藥物裝載及釋放

圖4 (a)不同起始ZOL濃度下的藥物裝載量；(b)37℃PBS中不同時(shí)間、不同藥物裝載量的HA-w、H/M-w及H/M/B-w的藥物釋放曲線(xiàn)

在我們的研究中MSN承擔(dān)了裝載ZOL藥物分子的作用。我們記錄了在H/M-w及HA-w中不同起始ZOL溶液濃度與裝載藥物量之間的關(guān)系(圖4a，彩圖見(jiàn)插頁(yè))，用HPLC測(cè)量并記錄的HA-w、H/M-w及H/M/B-w特定的不同時(shí)間點(diǎn)釋放入PBS中的ZOL濃度，形成藥物釋放曲線(xiàn)。(圖4b，彩圖見(jiàn)插頁(yè))

3 討論

近十年來(lái)，隨著生物涂層技術(shù)人工髖關(guān)節(jié)上的成功應(yīng)用[2,3]，裝載各種生物活性成分的生物涂層內(nèi)固定材料也紛紛興起，如裝載生長(zhǎng)因子(IGF,TGF)[4,5]、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)[6]等。但這它們均存在分子量較大，在有限的涂層載體中，載藥量較少，藥物劑量可調(diào)區(qū)間有限，功效較差；且費(fèi)用昂貴，獲得困難，不適合大范圍的臨床使用等缺點(diǎn)。第三代雙磷酸鹽唑來(lái)膦酸，是一種有力的破骨細(xì)胞骨吸收抑制劑[7-9]。研究表明唑來(lái)膦酸通過(guò)同時(shí)刺激成骨細(xì)胞分泌骨保護(hù)素和抑制NF-B配體的受體激活劑的形成來(lái)平衡骨質(zhì)吸收[10]。有研究表明在內(nèi)固定物周?chē)植酷尫胚騺?lái)膦酸可以起到穩(wěn)定內(nèi)固定物并增加機(jī)械穩(wěn)定性的作用[11-13]。最近，有作者提出ZOL的這種作用與其延遲了原始骨痂的塑性有關(guān)：即在骨折修復(fù)早期，高濃度ZOL僅抑制破骨性骨重吸收作用，并不抑制破骨細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致原始骨痂轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒旃丘璧倪^(guò)程推遲，從而避免在骨性連接形成前原始骨痂被過(guò)早的清除，不斷累積的原始骨痂為骨折端的修復(fù)重建創(chuàng)造了良好的力學(xué)穩(wěn)定性；在骨折修復(fù)中、后期，隨著ZOL的濃度逐漸減低，被抑制的破骨性骨重吸收作用逐漸恢復(fù)，原始骨痂塑性恢復(fù)正常，成熟骨痂不斷形成，從而進(jìn)一步加強(qiáng)骨折端的力學(xué)穩(wěn)定性[14]。

近年來(lái)最為常用的內(nèi)固定物涂層材料就是羥基磷灰石（HA）[15-18]，之前的研究表明作為藥物載體HA與ZOL之間是通過(guò)化學(xué)鍵進(jìn)行結(jié)合[19]，但這種結(jié)合在溶液中勢(shì)必導(dǎo)致藥物的釋放無(wú)法控制。同時(shí)，生物可降解聚合材料也被研究應(yīng)用于作為內(nèi)固定物的表面改造材料，如聚甲基甲丙烯酸鹽(PMMA)[20]，聚乳酸 (PLA)[21,22]，多聚羥基乙酸 (PGA)[23]及他們的共聚物。如ZOL之類(lèi)的藥物均需要通過(guò)溶解于有機(jī)溶劑來(lái)附著于多聚物的表面，從而形成藥物加載的內(nèi)置物。但由于有機(jī)溶劑的使用勢(shì)必會(huì)帶來(lái)毒性作用或者對(duì)藥物活性產(chǎn)生抑制。而且近期的研究表明，生物可降解聚合材料的酸性降解產(chǎn)物會(huì)打破其周?chē)鷥?nèi)環(huán)境的酸堿平衡，從而導(dǎo)致對(duì)骨折愈合不利的繼發(fā)炎癥的產(chǎn)生[24,25]。多孔材料作為藥物釋放載體已經(jīng)有10余年的研究歷史[26-28]，以多孔氧化鈦[29]、氧化多孔硅[30,31]及多孔生物玻璃[32]研究的最多。其具有多項(xiàng)適合作為體內(nèi)藥物釋放載體的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)多孔介質(zhì)的涂布是在蒸發(fā)過(guò)程中實(shí)現(xiàn)的自裝配過(guò)程[33]。在單純多孔材料涂層上，由于涂層很薄且藥物與之結(jié)合很弱，導(dǎo)致其藥物裝載量受限[34]。由于沒(méi)有另外的涂層包裹，所以弱結(jié)合的藥物易于快速的解離釋放，難以控制藥物的釋放。所以如何加大載藥量及控制藥物釋放仍然是生物涂層面技術(shù)臨的挑戰(zhàn)。

在我們的研究中，如圖3顯示的HA及HA/MSN粉末的氮吸附/解離等溫線(xiàn)。HA/MSN等溫線(xiàn)在P/P0為0.2左右時(shí)顯示了一個(gè)小的滿(mǎn)孔跳躍，相比之下純HA包被物未顯示出明顯的"滿(mǎn)孔跳躍"。由于微孔結(jié)構(gòu)的存在使HA/MSN涂層的BET比表面積明顯增大，約為HA包被物粉末的10倍。這種特性為藥物的吸附提供了更多的空間，從圖中就可明顯看出單位質(zhì)HA/MSN的N2吸附量明顯超過(guò)HA。如我們所期望的，圖4顯示了H/M-w的ZOL藥物裝載量明顯高于HA-w。正如之前的文獻(xiàn)中提到的HA與ZOL以化學(xué)鍵的形式結(jié)合，所以HA-w的表面積限制了ZOL與之大量結(jié)合。但是微孔結(jié)構(gòu)極大地?cái)U(kuò)大了與ZOL相結(jié)合的面積。而且ZOL與HA-w及H/M-w的結(jié)合為初始濃度相關(guān)，即提高ZOL的濃度可以增大裝載量。例如，H/M-w浸入在20 g/ml的ZOL溶液中可以裝載14.06g/cm的藥物量，但在5g/ml的溶液中就只能裝載4.48 g/cm。我們推測(cè)這是由于溶液濃度更大時(shí)對(duì)ZOL分子進(jìn)入微孔有更大的驅(qū)動(dòng)力導(dǎo)致的。如之前的文獻(xiàn)中所提到的，HA-w中的ZOL幾乎在3天內(nèi)全部釋放完[11]。相比之下H/M-w顯示出了更加持久的藥物釋放特性。以H/M-w-10為例，在第1天其幾乎噴發(fā)性的釋放了約50%的藥物裝載量。這種噴發(fā)性的釋放可能是由于附著在HA表面以及在微球表面的藥物解離。然而即便如此，H/M-w噴發(fā)性釋放的百分率仍然明顯小于HA-w，這歸功于微球?qū)τ谒幬锓肿拥谋３肿饔谩/M-w樣品在剩余的30%的藥物釋放過(guò)程中則顯示出明顯的持續(xù)性緩慢釋放的特征，并一直持續(xù)了10天以上。

我們?cè)谥暗难芯恐衃35]已發(fā)現(xiàn)在 -磷酸三鈣 (-TCP)的微孔表面涂布介孔二氧化硅微球 (MSN)，并在藥物加載后在MSN/-TCP復(fù)合體上覆蓋一層生物玻璃可以進(jìn)一步增加該復(fù)合體的藥物緩釋時(shí)間。在此次的藥物釋放實(shí)驗(yàn)中，我們也發(fā)現(xiàn)當(dāng)在加載了ZOL的H/M-w樣品上涂布生物玻璃后其藥物釋放的緩釋特性明顯增強(qiáng)，藥物釋放時(shí)間明顯延長(zhǎng)。我們認(rèn)為生物玻璃覆蓋涂層的方法使介孔開(kāi)口部分封閉，延緩藥物由孔道內(nèi)向外釋放的速度，進(jìn)一步提高了復(fù)合涂層的藥物緩釋作用。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)在整體藥物釋放百分率比較接近的情況下，最初裝載的藥物越多在最初階段的藥物釋放率就要更快。這可能意味著起始藥物濃度越高進(jìn)入微孔中的藥物量越少。微球形成的微孔加上生物玻璃能夠同時(shí)提高藥物裝載量并能夠保存藥物分子使之緩慢釋放，而這正與我們想要利用ZOL局部濃度"早高晚低"從而抑制破骨作用并且促進(jìn)成骨作用的目的相一致。

綜上所述，HA/MSN/BG復(fù)合涂層具有載藥量大、附著牢固及價(jià)格經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，加載ZOL后不僅能夠進(jìn)行局部藥物緩慢釋放，并且其釋放特性也復(fù)合ZOL藥物的作用特點(diǎn)，且ZOL相比生長(zhǎng)銀及骨形態(tài)發(fā)生蛋白等價(jià)格便宜，易于取得和大規(guī)模臨床應(yīng)用。這將為生物涂層復(fù)合內(nèi)固定物在骨折愈合方面的臨床應(yīng)用開(kāi)辟新的領(lǐng)域，為臨床上更多具有內(nèi)固定后骨不連高風(fēng)險(xiǎn)的患者提供更加適合的治療選擇。但本實(shí)驗(yàn)作為初步的探索僅僅針對(duì)HA/MSN/BG的表征及體外理化特性進(jìn)行了研究，并未對(duì)其在體外如何影響成骨細(xì)胞、抑制骨吸收及細(xì)胞毒性等方面進(jìn)研究，我們將在今后的后續(xù)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中對(duì)這些方面的問(wèn)題進(jìn)行深入細(xì)致的探究，并通過(guò)在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該復(fù)合生物涂層的促進(jìn)骨折愈合的作用。

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In vitro characterizations of novel mesoporous silica nanoparticles/hydroxyapatite/bioactive glass composite coat

Deng Yuan,Guo Xiang*.Chang Zheng Hospital,Secondary Military Medical University,Shanghai 200003,China

Objective The use biological coat in inner fixation is a new star of healing fracture and bone nonunion.In an attempt to improve implant-bone integration and accelerate bone fracture healing,we prepared a novel mesoporous silica nanoparticulate/hydroxyapatite/bioactive glass composite coat.Characterizations and drug release characters which was loaded with Zoledronic acid was investigated in our experiment.Methods Characterizations of H/M coating was investigated by SEM,TEM and EDS.The H/M/B composite coat was contrasted with HA coat in the drug load and release experiment by HPLC.Results Pictures of SEM and TEM show that innumerable micropores was formed by silica nanoparticulates on the H/Mcoat.Bigger drug load and sustained release of drug was observed compared to HA coat.Sustained releasing was more obvious when H/M was coated by bioactive glass.Conclusion The novel composite coat had a series merits compared to actual biological coat like big load of drug,sustained drug release,economic and non-toxic.It gave us a new choice of inner fixation to deal with fracture in the future.

Mesoporous silica nanoparticulate;Bioactive glass;Zoledronic acid;Characterizations;Drug release

R318.08

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2014.05.003

swgk2014-02-0020

鄧元(1987-)男，博士，醫(yī)師。研究方向:骨科生物材料。

*[通訊作者]郭翔(1978-)男，博士，主治醫(yī)師。研究方向:骨科生物材料。

2014-02-17)

國(guó)家自然科學(xué)基金(81101343)，上海市衛(wèi)生局科研基金(基金號(hào)2011254)

第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院，上海 200003