c-FLIP在惡性血液病中的表達(dá)及其臨床相關(guān)性研究

宋 敏，王建寧，孟慶齊，包紅雨，陸 化

（1.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科，江蘇 南京 210011；

2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，江蘇 南京 210029）

c-FLIP在惡性血液病中的表達(dá)及其臨床相關(guān)性研究

宋 敏1，王建寧1，孟慶齊1，包紅雨1，陸 化2

（1.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科，江蘇 南京 210011；

2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科，江蘇 南京 210029）

目的探討c-FLIP基因在血液腫瘤中的表達(dá)以及臨床意義。方法以半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)22例血液腫瘤骨髓中的c-FLIP mRNA表達(dá)，Western-Blot蛋白質(zhì)印跡(WB)方法檢測(cè)其c-FLIP蛋白的表達(dá)。病例包括急性白血病(AL)12例(其中初治11例及反復(fù)復(fù)發(fā)1例)、完全緩解(CR)后AL 2例、慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)2例、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)2例、多發(fā)性骨髓瘤(MM)2例和骨髓增生異常綜合征-難治性貧血伴原始細(xì)胞增多2型(MDS-RAEB-2)2例。結(jié)果初治和復(fù)發(fā)AL，初治CML、CLL、MDS-RAEB-2、MM患者c-FLIP mRNA和蛋白均表達(dá)異常增高。初治AL c-FLIP mRNA及43 kD蛋白的表達(dá)顯著高于慢性白血病(CL)(P＜0.05)。MDS-RAEB-2、MM與ALc-FLIP mRNA的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，但MDS 55 KD、43 KD蛋白表達(dá)明顯低于AL(P＜0.05)，而MM無(wú)明顯差異。對(duì)照組mRNA及其蛋白均陰性表達(dá)，CR后AL mRNA陰性表達(dá)，但其蛋白均有表達(dá)，低表達(dá)于AL，尤其43 kD明顯低于AL(P＜0.05)。c-FLIP表達(dá)在初治AL患者與其年齡、性別、初診白細(xì)胞數(shù)、LDH以及核型、免疫表型無(wú)關(guān)。AL患者c-FLIP mRNA及其蛋白表達(dá)與初治療效無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)。結(jié)論血液腫瘤患者c-FLIP mRNA及其蛋白表達(dá)異常增高，能夠反映出惡性血液病患者骨髓造血細(xì)胞的凋亡抑制情況，與惡性血液病的類(lèi)型、疾病的狀態(tài)以及病程中的臨床療效、預(yù)后等都密切相關(guān)。

c-FLIP；惡性血液??；RT-PCR；Western blot

惡性血液病是一類(lèi)難治性血液系統(tǒng)腫瘤，治療棘手，生存期短，預(yù)后差，具體發(fā)病機(jī)制至今尚未明了。凋亡異常是惡性血液病發(fā)病和耐藥的重要機(jī)制之一。對(duì)白血病及其他腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究和探索有利于幫助該類(lèi)患者改善臨床緩解率、克服耐藥及改善預(yù)后[1]。細(xì)胞型Fas相關(guān)死亡區(qū)域蛋白樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(c-FLIP)為新發(fā)現(xiàn)的直接作用于Caspase介導(dǎo)的凋亡途徑終極部位的凋亡抑制蛋白，它含有兩個(gè)連續(xù)的N端死亡效應(yīng)域(DED)，其后包含一個(gè)由C端延伸的Caspase結(jié)構(gòu)類(lèi)似區(qū)域，但無(wú)蛋白水解酶的活性，而可以競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)合于含死亡結(jié)構(gòu)域(DD)Fas相關(guān)蛋白(FADD)或者Caspase-8的DED，進(jìn)一步的阻斷了死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體(DISC)形成；強(qiáng)效的抑制死亡受體(DR)——Fas、TRAIL(腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體)-R、TNFR1(腫瘤壞死因子的受體)誘導(dǎo)下的細(xì)胞調(diào)亡。

本研究使用RT-PCR檢測(cè)22例血液惡性腫瘤患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞的c-FLIP的mRNA表達(dá)，以及采用Western-Blot方法檢測(cè)其c-FLIP蛋白表達(dá)水平，同時(shí)分析了c-FLIP mRNA與蛋白表達(dá)的相關(guān)性，及不同分子量的c-FLIP蛋白在不同患者中的表達(dá)情況。對(duì)惡性血液病患者體內(nèi)細(xì)胞凋亡的激活狀態(tài)進(jìn)行了初步的探索，并探討了c-FLIP基因與血液惡性腫瘤的不同類(lèi)型、疾病的不同狀態(tài)和臨床療效及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 急性白血病(AL)12例，其中初治急性非淋巴細(xì)胞白血病(ANLL)7例(1例M1，2例M2，2例M3，2例M5)，初治急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)3例(1例伴ph+，1例伴髓系表達(dá))，1例初治急性混合細(xì)胞白血病，1例反復(fù)復(fù)發(fā)M1，2例完全緩解(CR)后M2，2例初治慢性粒細(xì)胞性白血病(CML)，2例初治慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，多發(fā)性骨髓瘤(MM)初治患者2例，骨髓增生異常綜合征-難治性貧血伴原始細(xì)胞增多2型(MDS-RAEB-2)初治患者2例。骨髓標(biāo)本來(lái)自于2006年10月至12月的住院和門(mén)診患者，其中男性15例，女性7例，年齡16～71歲(平均47歲)。同時(shí)采用2例同期輕度白細(xì)胞數(shù)減少，骨髓象正常的患者作為正常對(duì)照組。以張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》作為急性白血病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照及白血病完全緩解標(biāo)準(zhǔn)參照。

1.2 方法

1.2.1 骨髓標(biāo)本的采集方法和單個(gè)核細(xì)胞(MNC)分離 以無(wú)菌操作抽取22例惡性血液病患者和2例對(duì)照者的抗凝骨髓4 ml，加入等量PBS稀釋后以淋巴細(xì)胞分離液分離出骨髓的MNC，PBS洗滌兩次后在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整MNC的濃度至3×106個(gè)，采用常規(guī)凍存的方法將標(biāo)本放于-70℃凍存以備用。

1.2.2 RT-PCR 將凍存細(xì)胞復(fù)蘇以后，以PBS液洗滌3次，以Trizol Reagent(美國(guó)Invitrogen公司)提取細(xì)胞中的總RNA，生物分光光度計(jì)(德國(guó)，Eppendorf公司)測(cè)定其D260/D280值均在1.8～2.0，在瓊脂糖變性凝膠電泳上見(jiàn)28S和18S條帶，證明細(xì)胞標(biāo)本中的RNA無(wú)降解。以25 μl的反應(yīng)體系(美國(guó)，Promega公司)，其中包含有2 μg總RNA，2 μl的Oligo(dT) (0.5 μg/μl)，5 μl的5×RT Buffer，2.5 μl的dNTP mix，3 μl的AMV Reverse Transcriptase，1 μl的Rnasin Ribomuclease Inhibitor(10 U/μl)。在42℃水浴中1 h，在95℃時(shí)終止其反應(yīng)5 min，所得的cDNA在-20℃保存以備用。在50 μl的反應(yīng)體系里包含2 μl的cDNA，5 μl的10×Buffer，1 μl(0.2 mmol/L)的dNTP mix，一對(duì)各1.25 μl引物，0.5 μl的Tag酶(5U/μl)，3 μl的MgCl2(1.5 mmol/L)；在95℃時(shí)預(yù)變性5 min、94℃30 s、57℃30 s、72℃45 s，共35個(gè)循環(huán)。在72℃延伸5 min。取其擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳30 min(電壓為110 V，0.5×TBE為緩沖液)。以凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)，Cold Spring)進(jìn)行信號(hào)的掃描，用Quantity One4.5.2軟件(美國(guó)，Bio Rad)定量分析。以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為內(nèi)參。半定量分析擴(kuò)增條帶以目的條帶/內(nèi)參輝度值作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀測(cè)指標(biāo)。

1.2.3 Western Blot蛋白質(zhì)印跡 采集好的細(xì)胞標(biāo)本在復(fù)蘇后用PBS洗滌3次，按照蛋白抽提試劑盒所提供操作步驟來(lái)提取出標(biāo)本的總蛋白并測(cè)定蛋白的濃度。蛋白上樣后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，使用電轉(zhuǎn)儀(美國(guó)，Bio Rad公司)，把蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜(美國(guó)，Bio Rad公司)上，在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用脫脂奶粉溶液封閉過(guò)夜，與兔抗FLIP多抗(R&D公司)在室溫下孵育1 h，以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔的二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)室溫孵育1 h，最后用ECL化學(xué)發(fā)光(PIERCE公司)，X光片曝光后顯影、定影。通過(guò)成像軟件Quantity One 4.5.2，與Beta.actin對(duì)比后進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩樣本均數(shù)比較使用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，兩兩比較方法采用Scheffe法。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 c-FLIP基因的mRNA和c-FLIP基因的蛋白在血液腫瘤患者中的表達(dá) 血液腫瘤患者骨髓的單個(gè)核細(xì)胞中c-FLIP基因的mRNA及其蛋白均檢測(cè)出表達(dá)的異常增高。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示所有惡性血液病患者骨髓核細(xì)胞中，均呈現(xiàn)c-FLIP蛋白表達(dá)(圖1)，所有患者均表達(dá)c-FLIPL(55 kD)、p43-FLIPL(43 kD)、c-FLIPS(26 kD)、p33-FLIPL(33 kD)、p22-FLIPL(22 kD)等。

圖1 惡性血液病患者cFLIP基因的蛋白表達(dá)

2例正常對(duì)照者mRNA及其蛋白均陰性表達(dá)。2例治療完全緩解后AL患者mRNA的表達(dá)為陰性，但其c-FLIP蛋白均有表達(dá)，但低于12例(初治+復(fù)發(fā))AL的c-FLIP表達(dá)，同時(shí)兩者之間的43 kD表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。白血病患者c-FLIP mRNA及其55 kD、43 kD蛋白表達(dá)見(jiàn)表1。初治ANLL和初治ALL的c-FLIP mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但55 kD的表達(dá)ALL顯著高于ANLL，43 kD蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異。其中1例急性混合細(xì)胞白血病：55 kD：0.49；43 kD，0.62；mRNA，0.89。1例反復(fù)復(fù)發(fā)并且多種化療藥物耐藥的M1患者c-FLIP基因的mRNA表達(dá)(0.99)明顯增高，蛋白表達(dá)亦明顯增高，55 kD：2.0；43 kD：1.9。AL c-FLIP mRNA及其43 kD蛋白的表達(dá)顯著高于慢性白血病(CL)，55 kD蛋白的表達(dá)亦高于CL，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。其中2例CML蛋白55 kD表達(dá)(0.50±0.00)、43 kD(0.50±0.01，P=2)均低表達(dá)于12例AL，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；但CMLmRNA表達(dá)(0.43±0.01)，顯著低于AL的表達(dá)(P＜0.05)。2例CLL蛋白55 kD表達(dá)(0.90±0.14)、43 kD表達(dá)(0.48±0.11，n=2)、mRNA表達(dá)(0.80±0.04)均低表達(dá)于AL，尤其43 kD蛋白的表達(dá)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；2例CLL的55 kD蛋白(0.90±0.14)的表達(dá)亦高于2例CML(0.50±0.00)。2例MM蛋白55 kD表達(dá)(0.45±0.07)、43 kD(0.45±0.07，n=2)、mRNA表達(dá)(0.73±0.15)均低表達(dá)于AL，尤其是蛋白的表達(dá)，但由于病例少，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。2例MDS者55 kD表達(dá)(0.20±0.00)、43 kD(0.20±0.00，n=2)均明顯低于AL的表達(dá)(P＜0.05)，而其mRNA表達(dá)(0.83±0.04)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 白血病患者c-FLIP mRNA及其55 kD、43 kD蛋白表達(dá)()

表1 白血病患者c-FLIP mRNA及其55 kD、43 kD蛋白表達(dá)()

55 kD檢驗(yàn)值P值43 kD檢驗(yàn)值P值mRNA檢驗(yàn)值P值0.81±0.25 -2.76 0.025 0.91±0.18 0.53 0.61 0.89±0.30 -0.54 0.61 1.38±0.41 -2.76 0.025 0.84±0.23 0.53 0.61 0.99±0.23 -0.54 0.61 1.03±0.49 1.54 0.15 0.95±0.35 3.03 0.01 0.92±0.25 5.05 0.00 0.48±0.35 1.54 0.15 0.18±0.04 3.03 0.01 0.00 5.05 0.00 1.03±0.49 1.56 0.14 0.95±0.35 3.17 0.01 0.92±0.25 2.62 0.018 0.69±0.23 1.56 0.14 0.49±0.05 3.17 0.01 0.61±0.20 2.62 0.018

2.2 c-FLIP基因的表達(dá)與急性白血病患者臨床特征的相關(guān)性 分析c-FLIP基因mRNA及c-FLIP基因蛋白的表達(dá)與初治急性白血病患者的年齡、性別、初診時(shí)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、LDH及核型的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)其差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。但其中多種染色體異常的患者[除去僅有t(15；17)者]55 kD蛋白表達(dá)高于正常染色體者(P＜0.05)，病例數(shù)尚需累積。

2.3 c-FLIP基因的表達(dá)與初發(fā)急性白血病的免疫表型的關(guān)系 用流式細(xì)胞術(shù)來(lái)檢測(cè)白血病細(xì)胞的CD13、CD33、CD34、HLA-DR的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD13、CD33陽(yáng)性組55 kD、45 kD、mRNA表達(dá)分別為(0.92±0.56)、(0.77±0.22)、(0.77±0.22)(n=9)；CD13、CD33陰性組分別為(0.88±0.34)、(0.78±0.37)、(0.88±0.37，n=2)，表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CD34、HLA-DR陽(yáng)性組55 kD、45 kD、mRNA表達(dá)分別為(0.93±0.26)、(0.78±0.43)、(0.94±0.33，n=8)；陰性組分別為[(0.89±0.38)、(0.77±0.27)、(0.76±0.32)，n=3]，表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。CD13陽(yáng)性的表達(dá)組和CD33陽(yáng)性的表達(dá)組其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4 c-FLIP基因的表達(dá)與急性白血病的首次治療療效的關(guān)系 2例初治的M3患者均完全緩解(CR)，其余9例初治AL中1例治療相關(guān)性死亡，1例ALL(伴髓系表達(dá))沒(méi)有治療，其總的CR率為66.67% (6/9)。初發(fā)的AL首次化療以后未能達(dá)到CR(NR)者c-FLIP基因的mRNA表達(dá)[(0.91±0.03)，n=3]高于達(dá)到CR的患者[(0.67±0.21)，n=4]，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.23)，與我們既往研究一致。55 kD蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NR者[(0.92±0.61)，n=3]；CR者[(0.83±0.28)，n=4]；43 KD蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NR者[(0.56±0.08)，n=3]；CR者[(0.70±0.26)，n=4]。1例急性混合細(xì)胞白血病為治療相關(guān)死亡mRNA表達(dá)0.89，但蛋白表達(dá)55 kD：0.49；45 kD：0.62，卻無(wú)明顯的蛋白表達(dá)增高。1例急性淋巴細(xì)胞白血病伴ph+者mRNA表達(dá)0.93，但蛋白表達(dá)55 kD：1.35；45 kD：0.58，55 kD表達(dá)亦明顯增高，患者臨床治療未達(dá)緩解，最終死亡。1例反復(fù)復(fù)發(fā)并且多種化療藥物耐藥M1患者c-FLIP基因的mRNA表達(dá)(0.99)明顯升高，蛋白表達(dá)亦明顯增高，55 kD：2；45 kD：1.9，且反復(fù)治療未能達(dá)CR，最終死亡。

表2 c-FLIP基因表達(dá)與初治急性白血病臨床特征的關(guān)系()

表2 c-FLIP基因表達(dá)與初治急性白血病臨床特征的關(guān)系()

年齡(歲)≥18＜18檢驗(yàn)值P值性別1.04±0.54 0.99±0.00 0.11 0.91 0.95±0.39 0.95±0.00 0.01 0.99 0.93±0.27 0.88±0.11 0.28 0.78男女檢驗(yàn)值P值白細(xì)胞數(shù)(×109/L)≥50＜50檢驗(yàn)值P值乳酸脫氫酶(U/L)≥600＜600檢驗(yàn)值P值核型正常其他[除外t(15;17)]檢驗(yàn)值P值9 2 5 6 3 8 5 6 4 5 1.16±0.54 0.85±0.40 1.08 0.31 1.04±0.42 0.83±0.21 1.03 0.33 0.90±0.28 0.95±0.23 -0.31 0.76 0.92±0.48 0.94±0.43 -0.08 0.94 0.67±0.29 0.86±0.20 -1.16 0.28 1.02±0.29 0.89±0.28 0.68 0.52 0.84±0.25 1.03±0.56 -0.69 0.51 0.87±0.24 0.73±0.22 0.96 0.36 0.97±0.28 0.90±0.30 0.42 0.69 0.60±0.27 1.03±0.21 -2.56 0.043 0.76±0.22 0.88±0.20 -0.80 0.45 0.87±0.38 0.95±0.19 -0.37 0.72

2.5 c-FLIP mRNA、55 kD、43 kD蛋白表達(dá)相關(guān)性分析 分析12例AL患者c-FLIP mRNA、55 kD、43 kD蛋白表達(dá)相關(guān)性分析：c-FLIP 55 kD蛋白的表達(dá)與其mRNA表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.249，P=0.435，P＞0.05)；c-FLIP 43 kD蛋白的表達(dá)與其mRNA表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.296，P=0.351，P＞0.05)；但c-FLIP 55 kD蛋白和43 kD蛋白表達(dá)存在相關(guān)性(r=0.655，P=0.021，P＜0.05)。其中ANLL、ALL患者的c-FLIP 55 kD、43 kD蛋白表達(dá)與其mRNA亦無(wú)明顯相關(guān)性(P＞0.05)。

3 討論

c-FLIP是一種新近發(fā)現(xiàn)的直接作用于Caspase環(huán)節(jié)的凋亡抑制蛋白，由Irmler等[2]1997年首先在研究惡性黑色素瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)。c-FLIP基因定位在人類(lèi)染色體的2q33，它的mRNA的表達(dá)形式有多種的拼接亞型，但目前研究顯示其在體內(nèi)表達(dá)的蛋白形式僅有FLIPL、FLIPS、FLIPR三種亞型。FLIPL的相對(duì)分子質(zhì)量為55 kD，F(xiàn)LIPS為26 kD。研究表明，這兩種亞型均能顯著的抑制FAS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[3]。FLIPR是新發(fā)現(xiàn)的分子量更小的而其功能類(lèi)似于FLIPS的表達(dá)蛋白[4]。在Fas介導(dǎo)的死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，隨著Fas的刺激，DISC的形成，proCaspase-8與DISC的結(jié)合后，首先裂解產(chǎn)生p43/p41和p12兩個(gè)亞單位；然后列解成為活性酶亞單位p18和p10，并產(chǎn)生p26/p24原結(jié)構(gòu)域。最后以形成的活性的Caspase-8異四倍體(p102-p182)形式釋放入細(xì)胞漿而傳導(dǎo)細(xì)胞的凋亡信號(hào)?；钚訡aspase-8直接導(dǎo)致下游的效應(yīng)分子proCaspase-3, 7,9的活化，并裂解下游效應(yīng)Caspases[5]。c-FLIP因其結(jié)構(gòu)與Caspase-8/10的相似性，而競(jìng)爭(zhēng)性的強(qiáng)效的抑制了Caspase介導(dǎo)的凋亡。

FLIP除了通過(guò)與DISC的綁定而發(fā)揮其抑制凋亡外，Thome等[6]研究中發(fā)現(xiàn)，在NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，高濃度c-FLIPL亦能激活NF-κB[7]。Kataoka等[8]研究揭示，由c-FLIPL介導(dǎo)的NF-κB活化需要p43-FLIP片斷的參與。2006年，Golks等[9]研究發(fā)現(xiàn)了新的FLIP片段：p22-FLIP。研究發(fā)現(xiàn)，在惡性腫瘤細(xì)胞、成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)、原始T、B淋巴細(xì)胞中，p22-FLIP為激活NF-κB關(guān)鍵的中介物，它通過(guò)IKKγ亞基與IKK復(fù)合物直接綁定，強(qiáng)烈的誘導(dǎo)了NF-κB的激活。該研究揭示了c-FLIP介導(dǎo)的激活NF-κB在淋巴細(xì)胞中生存/死亡決策的新機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)p43-FLIP和c-FLIPL需要進(jìn)一步裂解為p22-FLIP以誘導(dǎo)NF-κB活化，提出p22-FLIP是c-FLIP誘導(dǎo)NF-κB活化的最終產(chǎn)物。而體外實(shí)驗(yàn)顯示，活化的成熟的Caspase-8異四聚體p102-p182裂解c-FLIPL產(chǎn)生p12-FLIP和p43-FLIP，而不是p22-FLIP。

文獻(xiàn)顯示c-FLIPL在其發(fā)揮生存/死亡決策的新機(jī)制的作用過(guò)程中，進(jìn)一步被裂解為p43-FLIP、p12-FLIP以及p22-FLIP等活性裂解產(chǎn)物和COOH-末端的p33-FLIP等片段，在凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮了其凋亡抑制和調(diào)節(jié)的基本功能。我們本次研究顯示：在惡性血液病患者的骨髓單個(gè)核細(xì)胞裂解液中存在c-FLIPS(26 kD)、c-FLIPL(55 kD)、p43-FLIP(43 kD)、p33-FLIP(33 kD)、p22-FLIP(22 kD)等c-FLIP裂解產(chǎn)物，提示在惡性血液病患者體內(nèi)存在著c-FLIP抑制FAS等死亡受體誘導(dǎo)的凋亡，激活NF-κB等抗凋亡途徑而發(fā)揮了其在生存/死亡決策新機(jī)制中重要的決定和調(diào)節(jié)的作用。因此，我們希望通過(guò)進(jìn)一步探討惡性血液病患者的c-FLIP表達(dá)與臨床特征、治療、預(yù)后相關(guān)性的分析，為人們?cè)谔剿髦斡鷲盒匝翰〉闹委煂W(xué)中提供一個(gè)新途徑。

惡性血液病因其發(fā)病機(jī)制不同，造血細(xì)胞的增殖、分化、凋亡的狀況亦有所不同，而決定了其為一大類(lèi)具有不同臨床表型、臨床特征及病程、不同的治療效果、不同預(yù)后的血液系統(tǒng)腫瘤。本次研究采用Western-Blot方法檢測(cè)惡性血液病患者c-FLIP基因蛋白表達(dá)的結(jié)果分析顯示：AL均呈現(xiàn)高表達(dá)，AL 43片段表達(dá)高于55 kD，只有髓系43 kD片段表達(dá)高些，ALL均略弱于AML。2例M3表達(dá)小于其他類(lèi)型者，可能與細(xì)胞的成熟度有關(guān)。1例混合型AL均強(qiáng)表達(dá)，1例反復(fù)復(fù)發(fā)M1患者均極強(qiáng)表達(dá)，高于其他，43 kD表達(dá)極強(qiáng)。1例M2 CR仍有55 kD表達(dá)，但43 kD以下表達(dá)非常弱。2例CLL 55 kD明顯強(qiáng)表達(dá)，甚至相近AL，但43 kD以下低表達(dá)弱55 kD，且小于AL。CML均低表達(dá)，明顯弱于CLL、AL。2例MM均表達(dá)，甚則43 kD大于55 kD，顯示其仍與疾病的惡性度有關(guān)。2例MDS患者均弱表達(dá)，43 kD大于55 kD，顯示其仍與疾病的預(yù)后、發(fā)展有關(guān)。CLL雖然是形態(tài)上類(lèi)似成熟淋巴的慢性白血病，但測(cè)定中顯示2例CLL 55 kD明顯強(qiáng)表達(dá)，甚至相近于AL，但43 kD以下低表達(dá)弱于55 kD，且小于AL。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們?nèi)韵Ｍ龃蟛±龜?shù)檢測(cè)數(shù)據(jù)來(lái)更好的進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，有助于幫助評(píng)判各片段在惡性血液病中表達(dá)的臨床和發(fā)病機(jī)制的研究。對(duì)于其在臨床診療、預(yù)后判斷、治療選擇等方面存在的某種關(guān)聯(lián)性亦尚需積累病例數(shù)進(jìn)一步揭曉。

本次研究的結(jié)果提示：正常對(duì)照組c-FLIP基因的mRNA和蛋白表達(dá)均為陰性。已達(dá)CR的AL患者c-FLIP基因的mRNA表達(dá)也為陰性，但仍有c-FLIP蛋白表達(dá)，明顯低表達(dá)于初治AL，尤其是AL已達(dá)CR的患者的43 kD蛋白的表達(dá)與初治AL比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01，P＜0.05)。在血液惡性腫瘤患者中，c-FLIP mRNA、蛋白的表達(dá)均異常增高，所有初發(fā)、復(fù)發(fā)AL患者c-FLIP基因的蛋白均表達(dá)增高，復(fù)發(fā)患者的c-FLIP基因的蛋白表達(dá)也明顯升高，并且預(yù)后差，且對(duì)多種的化療藥物耐藥，療效差。其中1例多次更換化療方案疾病仍不能好轉(zhuǎn)，仍呈現(xiàn)高白，其原始細(xì)胞高達(dá)98%而最終死于出血和感染。本次研究未發(fā)現(xiàn)ANLL中c-FLIP基因的蛋白表達(dá)與患者的FAB分型或者患者的免疫表型有著密切的聯(lián)系(P＞0.05)，在一定程度上提示c-FLIP基因的蛋白表達(dá)可能與急性非淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞所處的分化階段并無(wú)明顯的關(guān)系，但尚需積累更多的病例資料以進(jìn)一步探索。盡管臨床上患者的首次治療后未能達(dá)CR的初發(fā)AL患者c-FLIP基因的mRNA表達(dá)高表達(dá)于可達(dá)到CR患者，但其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，本次研究未顯現(xiàn)c-FLIP蛋白的表達(dá)與臨床首次治療的緩解率有關(guān)(P＞0.05)。本研究分析AL患者c-FLIP 55 kD蛋白的表達(dá)與其mRNA表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(r= 0.249，P=0.435，P＞0.05)；c-FLIP 43 kD蛋白的表達(dá)與其mRNA表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.296，P=0.351，P＞0.05)；但c-FLIP 55 kD蛋白和43 kD蛋白表達(dá)存在相關(guān)性(r=0.655，P=0.021，P＜0.05)。但尚需積累更多病例資料統(tǒng)計(jì)，以助進(jìn)一步分析、揭示c-FLIP基因在惡性血液病患者體內(nèi)轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白表達(dá)的基本途徑，以期作用于臨床。

既往研究[10]顯示CLL患者c-FLIP mRNA表達(dá)明顯高于CML患者，因其疾病的狀態(tài)、疾病的惡性程度不同而低表達(dá)于AL。本次研究發(fā)現(xiàn)：CLL的c-FLIP蛋白的表達(dá)亦明顯增高，并明顯高于CML，而低于AL(P＞0.05)，尚需累積病例數(shù)。既往研究[10]提示初發(fā)慢性期CML患者的c-FLIP mRNA表達(dá)顯著低于初治AL，本次研究發(fā)現(xiàn)，其c-FLIP蛋白表達(dá)高于正常對(duì)照組，亦低于初發(fā)AL患者，但因病例數(shù)偏少，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。我們初步可以得出c-FLIP基因的蛋白表達(dá)與惡性血液病的類(lèi)型、疾病當(dāng)時(shí)所處的狀態(tài)和其不同的惡性程度有密切關(guān)系。有研究顯示MDS隨著病情的進(jìn)展，原始細(xì)胞的增多，出現(xiàn)了對(duì)Fas誘導(dǎo)的凋亡發(fā)生了抵抗的原始細(xì)胞組群。本研究中的2例MDS-RAEB-2患者的c-FLIP基因的mRNA表達(dá)明顯升高，與AL的cFLIP基因的mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但終因其惡性度低于AL患者，其c-FLIP蛋白表達(dá)明顯低于AL患者(55 kD，P=0.04，P＜0.05；43 kD，P=0.01，P＜0.05)，顯示c-FLIP的表達(dá)與疾病的進(jìn)程和預(yù)后密切相關(guān)。2例MM患者c-FLIP基因mRNA和c-FLIP基因的蛋白表達(dá)升高，但與AL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，這也提示其有助于對(duì)疾病的狀態(tài)及預(yù)后的判斷。因本文收集病例數(shù)偏少，尚需積累更多的臨床資料。

我們的研究顯示：c-FLIP基因是一種重要的惡性血液病相關(guān)的凋亡抑制蛋白。c-FLIP基因的表達(dá)水平與評(píng)價(jià)惡性血液病的疾病狀態(tài)、臨床療效、預(yù)后有著密切的相關(guān)性。檢測(cè)血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者體內(nèi)的c-FLIP基因的表達(dá)可以作為評(píng)估其病情的發(fā)展和判斷其預(yù)后的重要指標(biāo)。進(jìn)一步的闡明血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者的c-FLIP基因的作用機(jī)制也將有助于其基因治療的研究。而惡性血液病骨髓單個(gè)核細(xì)胞中c-FLIP的不同分子量蛋白的表達(dá)在疾病發(fā)病機(jī)制中所起的作用的真正途徑尚需進(jìn)一步積累病例研究。

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Expression and clinical significance of c-FLIP in hematologic malignancies.

SONG Min1,WANG Jian-ning1, MENG Qing-qi1,BAO Hong-yu1,LU Hua2.1.Department of Hematology,the Second Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210011,Jiangsu,CHINA;2.Department of Hematology,the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo explore c-FLIP(cellular FLICE inhibitory protein)expression and its clinical significance in hematologic malignancies.MethodsExpression level of c-FLIP mRNA and protein in bone marrow mononuclear cells was determined by Semi-Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction(Semi-RT-PCR)and Western blot in 22 patients of hematologic malignancies,which included 11 cases with newly diagnosed acute leukemia(AL),1 case of relapsed AL,2 cases of AL after complete remission(CR),2 cases of chronic myelocytic leukemia (CML),2 cases of chronic lymphocytic leukemia(CLL),2 cases of multiple myeloma(MM)and 2 cases of mycelodysplastic syndrome-refractory anemia with excess blasts-2(MDS-RAEB-2).ResultsExpression level of c-FLIP mRNA and protein were higher in patients with newly diagnosed or relapsed AL and newly diagnosed CML,CLL, MDS-RAEB-2,MM.Levels of c-FLIP mRNAand protein of 43 kD were higher inAL than in newly diagnosed chronic leukemia(CL),P＜0.05.There were no significant differences in mRNA between MDS-RAEB-2,MM and AL(P＞0.05).The levels of c-FLIP protein of 55 kD and 43 kD were lower in MDS than those in newly diagnosed AL(P＜0.05).The expression of normal subjects in mRNA and protein were negative.The expression of AL after CR was negative in mRNA,but positive in protein,and lower than AL,especially in protein of 43 kD(P＜0.05).The expression level of c-FLIP was not associated with age,sex,WBC,LDH,cytogenetic characteristics,immunophenotype(P＞0.05).There were no significant differences in that of curative effect(P＞0.05).Conclusionc-FLIP was highly expressed in hematologic malignancies.The level of expression reflected apoptosis of hematologic malignancies,and was closely related with the type and situation of hematologic malig-nancies,chemotherapeutic effects and prognosis.

c-FLIP;Hematologic malignancies;RT-PCR;Western blot

R552

A

1003—6350（2014）23—3439—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.23.1347

2014-06-17)

南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：2010NJMUZ49）

宋 敏。E-mail：songmin218@163.com