不同潮氣量的機(jī)械通氣對(duì)大鼠肺組織內(nèi)TNF-α和IL-10的影響

譚軍源，王春曉，陳麗青

(1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院廣東省人民醫(yī)院，廣東 廣州 510080；3.廣東省英德市人民醫(yī)院，廣東 英德 513000)

不同潮氣量的機(jī)械通氣對(duì)大鼠肺組織內(nèi)TNF-α和IL-10的影響

譚軍源1，王春曉2，陳麗青3

(1.南方醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院廣東省人民醫(yī)院，廣東 廣州 510080；3.廣東省英德市人民醫(yī)院，廣東 英德 513000)

目的 觀察不同潮氣量機(jī)械通氣對(duì)大鼠肺組織中TNF-α和IL-10的影響及其作用機(jī)制。方法 選取24只SD大鼠并隨機(jī)分成三組(F組、L組、H組)，每組8只，其中F組為插管不通氣組，L組給予10 ml/kg小潮氣量，H組給予40 ml/kg大潮氣量行機(jī)械通氣。L組與H組的通氣時(shí)間均為2 h，并在通氣的過(guò)程中給予維庫(kù)溴銨抑制呼吸。通氣結(jié)束24 h后，取各組大鼠的肺組織檢測(cè)濕干重比值(W/D值)，用ELISA法觀察肺組織勻漿中細(xì)胞因子(TNF-α，IL-10)蛋白的濃度，觀察肺組織病理改變并分析具體的作用機(jī)制。結(jié)果 L組和H組機(jī)械通氣后肺組織的TNF-α、IL-10蛋白含量表達(dá)均較F組有增高，其中H組與F組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，L組濃度雖有升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，此外H組較L組的升高變化也非常明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 大量的機(jī)械通氣會(huì)對(duì)大鼠造成明顯的肺損傷，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)，使得炎性因子TNF-α和IL-10含量產(chǎn)生變化，由此可以得出不同機(jī)械通氣量與大鼠的促炎及抑炎反應(yīng)有明顯相關(guān)性的結(jié)論。

機(jī)械通氣；肺損傷；TNF-α；IL-10

隨著機(jī)械通氣在臨床中治療急性呼吸窘迫綜合征、急性肺損傷及其他肺部呼吸困難病癥應(yīng)用的不斷推廣，針對(duì)不同通氣時(shí)間和不同通氣量對(duì)肺部損傷的研究也越來(lái)越多，許多實(shí)驗(yàn)研究表明不當(dāng)?shù)耐鈺r(shí)長(zhǎng)和通氣量會(huì)在不同程度上造成或加重患者的肺損傷[1]。本文從定量分析的角度入手，通過(guò)對(duì)比分析研究不同通氣量引發(fā)大鼠肺部組織炎性因子TNF-α和IL-10蛋白表達(dá)的濃度變化，探討機(jī)械通氣可能引發(fā)肺損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 本次試驗(yàn)的時(shí)間為2012年10月至2013年6月，試驗(yàn)動(dòng)物均由中山大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心提供，24只SD大鼠雌雄各半且為清潔級(jí)同批，體重200～250 g，為保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性在正式操作之前先適應(yīng)性飼養(yǎng)兩周(12 h-day/12 h-night)。按照隨機(jī)分配的原則將試驗(yàn)大鼠均分為三組，每組各8只，其中按照通氣方式和潮氣量大小的不同分為自由呼吸F組、大潮氣量通氣H組和小潮氣量通氣L組。

1.2 模型制備 手術(shù)和通氣之前先將三組大鼠用10%的水合氯醛0.35 g/100 g進(jìn)行腹腔注射麻醉，取仰臥位固定，行右頸總動(dòng)脈、尾靜脈置管術(shù)，右頸總動(dòng)脈置管采集生物信號(hào)，連續(xù)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(MAP)、心率(HR)、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)。待大鼠對(duì)口咽部刺激無(wú)反應(yīng)后經(jīng)口直視下插入14#靜脈套管針作為氣管導(dǎo)管，血壓穩(wěn)定后按照0.6 mg/kg的標(biāo)準(zhǔn)從尾靜脈緩慢推入由0.2 mg/ml生理鹽水稀釋維庫(kù)溴胺，待自主呼吸消失后，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣[2]。F組不進(jìn)行通氣且保留自主呼吸，L組潮氣量10 ml/kg，呼吸頻率為80次/min，H組40 ml/kg，呼吸頻率40次/min，維持機(jī)械通氣2 h。待試驗(yàn)動(dòng)物自主呼吸恢復(fù)平穩(wěn)后即停止機(jī)械通氣操作，按照先進(jìn)行氣管導(dǎo)管拔除，再將動(dòng)靜脈套管針拆除的順序，對(duì)所有大鼠實(shí)行靜脈壓迫和動(dòng)脈結(jié)扎止血操作，此時(shí)還應(yīng)主義對(duì)肌肉皮膚的縫合，最后將大鼠置于25℃恒溫環(huán)境中進(jìn)行24 h的恢復(fù)飼養(yǎng)。

1.3 標(biāo)本采集 通氣結(jié)束24 h后將所有試驗(yàn)大鼠按照0.35 g/100 g的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行10%水合氯醛的腹腔注射麻醉，待大鼠失去自主活動(dòng)意識(shí)后立即開(kāi)胸取出完整的肺組織，保證手術(shù)操作的準(zhǔn)確性和快捷性，避免對(duì)大鼠造成虐待，最后將肺組織置于-70℃的環(huán)境中進(jìn)行低溫保存待測(cè)。此外本次試驗(yàn)中炎性因子的測(cè)定采用的是ELISA法，具體的操作步驟和檢測(cè)方法按相關(guān)規(guī)程和試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)觀察 只插管未進(jìn)行通氣的F組，肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡間質(zhì)無(wú)水腫，肺泡腔清晰，無(wú)炎性浸潤(rùn)改變；L組肺泡腔內(nèi)略有少量巨噬細(xì)胞、淋巴和單核細(xì)胞，肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)少量滲出液；H組肺泡腔、血管旁和支氣管周?chē)写罅垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚，肺泡結(jié)構(gòu)遭到破壞且肺間質(zhì)有出血和水腫，肺部損傷較重，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察

2.2 各組大鼠肺組織中TNF-α、IL-10的濃度比較

2.2.1 H組與F組比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大潮氣量通氣H組比較未通氣的對(duì)照組F肺組織中TNF-α、IL-10蛋白含量表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 H組與F組TNF-α、IL-1濃度比較（，n=8）

表1 H組與F組TNF-α、IL-1濃度比較（，n=8）

組別H組F組檢驗(yàn)值P值TNF-α濃度(pg/ml) 135.61±27.80 31.87±9.0 5.871 0.025 IL-10濃度(pg/ml) 143.09±28.89 31.70±9.48 5.093 0.035

2.2.2 L組與F組比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小潮氣量同期組L對(duì)比未通氣的F組，肺組織中TNF-α、IL-10蛋白含量雖有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 L組與F組之間TNF-α、IL-10的濃度對(duì)比（，n=8）

表2 L組與F組之間TNF-α、IL-10的濃度對(duì)比（，n=8）

組別L組F組檢驗(yàn)值P值65.01±8.81 31.87±9.0 0.008 0.929 68.19±9.37 31.70±9.48 0.055 0.817 TNF-α濃度(pg/ml)IL-10濃度(pg/ml)

2.2.3 H組與L組比較 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大潮氣量通氣H組與小潮氣量通氣L組之間肺組織的TNF-α、IL-10蛋白含量表達(dá)比較，H組明顯高于L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，由此可以看出當(dāng)通氣量增大時(shí)，大鼠肺泡內(nèi)的細(xì)胞炎性因子含量也會(huì)發(fā)生明顯的升高變化，見(jiàn)表3。

表3 H組與L組的TNF-α、IL-10濃度比較（，n=8）

表3 H組與L組的TNF-α、IL-10濃度比較（，n=8）

組別H組L組檢驗(yàn)值P值TNF-α濃度(pg/ml) 135.61±27.80 65.01±8.81 5.504 0.029 IL-10濃度(pg/ml) 143.09±28.89 68.19±9.37 4.953 0.038

3 討論

過(guò)量的機(jī)械通氣會(huì)導(dǎo)致患者的肺組織損傷，通常所說(shuō)的“肺生物傷”已經(jīng)成為目前臨床治療和研究的共識(shí)，但是對(duì)其具體作用機(jī)制的研究仍處在探索的階段。細(xì)胞炎性因子作為能夠直接反映機(jī)體是否發(fā)生炎性反應(yīng)和判斷相關(guān)損傷程度的重要指標(biāo)，越來(lái)越受到臨床研究人員的重視，相關(guān)研究已經(jīng)證明在ARDS的發(fā)病過(guò)程中有多種炎癥因子參與并引發(fā)了肺組織損傷[3]。本文就從不同潮氣量引發(fā)大鼠肺組織中炎癥因子濃度變化的角度入手，分析了機(jī)械通氣引發(fā)肺損傷的作用機(jī)制，首先TNF-α是典型的促炎因子，主要由中性粒細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞分泌[4]。本次研究中肺組織損傷較為嚴(yán)重的H組其TNF-α的濃度出現(xiàn)了顯著的增長(zhǎng)，這一變化雖然屬于大鼠的正常應(yīng)激行為，由于該物質(zhì)分泌過(guò)多激活了二級(jí)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致肺損傷和肺部炎癥的加深。IL-10是一種典型的抗炎性因子，可以幫助機(jī)體發(fā)揮下調(diào)炎癥反應(yīng)，其主要是由胸腺細(xì)胞和T細(xì)胞等產(chǎn)生。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)IL-10可抑制巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞對(duì)促炎因子TNF-α、IL-8或IL-6的合成與釋放，降低粘附分子表達(dá)等[5]。對(duì)于此次的實(shí)驗(yàn)來(lái)講，在H組TNF-α濃度增加的同時(shí)，其IL-10含量也會(huì)出現(xiàn)明顯的升高變化，這就說(shuō)明炎性反應(yīng)的出現(xiàn)并不是單一的變化，而是處在一種相對(duì)平衡的狀態(tài)中。而L組與F組相比雖有所升高，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這就說(shuō)明小潮氣量的通氣可以降低肺部炎癥因子的產(chǎn)生。也有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)小潮氣量通氣可以對(duì)肺部產(chǎn)生一定的保護(hù)作用，減少或降低組織損傷的出現(xiàn)，有利于維持肺部炎性反應(yīng)間的平衡[6]。但是本研究的數(shù)據(jù)并不能為這一結(jié)論提供支持，分析問(wèn)題可能是由于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)過(guò)少或相關(guān)的檢測(cè)部位不同導(dǎo)致的。

總而言之，對(duì)于機(jī)械通氣引發(fā)肺部損傷而言，從炎性產(chǎn)生和發(fā)展的機(jī)制角度進(jìn)行研究，不僅有助于探明損傷的發(fā)生機(jī)制，同時(shí)還可以從調(diào)控免疫的角度進(jìn)行保護(hù)措施的探索或確切治療方法的選擇與研究。

[1]劉伯毅,鄭曉麗,鄭 翔,等.不同潮氣量機(jī)械通氣大白兔肺組織TNF-α和CC16的變化[J].廣西醫(yī)學(xué),2013,35(8):969-971.

[2]Fuller BM,Mohr NM,Drewry AM,et al.Lower tidal volume at initiation of mechanical ventilation may reduce progression to acute respiratory distress syndrome:a systematic review[J].Critical Care,2013,11:86-98.

[3]林 梵,肖 軍,張琛濤.不同潮氣量機(jī)械通氣對(duì)大鼠肺小窩蛋白-1及其相關(guān)信號(hào)鏈酶表達(dá)的影響[J].中華危重病急救醫(yī)學(xué), 2013,25(3):154-158.

[4]宋秀梅,王月蘭,劉 洋.不同潮氣量機(jī)械通氣誘發(fā)的肺損傷大鼠肺組織中CXCR2表達(dá)[J].臨床麻醉學(xué)雜志,2012,28(9): 905-907.

[5]林 飛,潘靈輝,錢(qián) 衛(wèi),等.IL-6、IL-8在不同潮氣量單肺通氣肺癌根治術(shù)中的表達(dá)[J].廣西醫(yī)學(xué),2012,34(7):825-826.

[6]Pan C,Wang JP,Liu W,et al.Low tidal volume protects pulmonary vasomotor function from“second-hit”injury in acute lung injury rats[J].Respiratory Research,2012,13:77-88.

Effects of mechanical ventilation with different tidal volumes on TNF-α and IL-10 in lung tissue of rats.

TAN Jun-yuan1,WANG Chun-xiao2,CHEN Li-qing3.1.Graduate School of Southern Medical University,Yingde 510515, Guangdong,CHINA;2.Guangdong Academy of Medical Sciences,Guangdong General Hospital,Guangzhou 510080, Guangdong,CHINA;3.People's Hospital of Yingde City,Yingde 513000,Guangdong,CHINA

Objective To observe the effects of different tidal ventilation volumes on TNF-α and IL-10 in lung tissue.Methods A total of 24 SD rats were randomly and equally divided into 3 groups(group F,group L, and group H).Group F was non-ventilation group,while group L and group H were given 10 ml/kg tidal volume and 40 ml/kg large tidal volume mechanical ventilation respectively.Ventilation time of group L and group H was 2 hours,and vecuronium bromide was applied to inhibit respiration during the ventilation process.24 h after ventilation, the lung tissue was taken for wet to dry weight ratio test(W/D value),and the concentrations of cytokines(TNF-α and IL-10)protein in lung tissue homogenates were detected by ELISA.Meanwhile,the pathological changes of lung tissue were observed and the underlying specific mechanism was analyzed.Results After mechanical ventilation,the expressions of TNF-α and IL-10 proteins in lung tissue in group L and group H were higher than those in group F,with significant difference between group H and group F(P＜0.05),but not between group L and group F(P＞0.05).Moreover,those proteins in group H showed statistically significant higher levels than those in group L(P＜0.01).Conclusion Mechanical ventilation amount will cause significant lung damage in rats,which leads to inflammation as well as changes of inflammatory factor TNF-α and IL-10.Therefore,different mechanical ventilation volumes are regarded to be closely related to proinflammatory and anti inflammatory reaction in rats.

Mechanical ventilation;Lung injury;TNF-α;IL-10

R-332

A

1003—6350（2014）18—2660—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.18.1045

2014-03-17)

王春曉。E-mail：149215956@qq.com