苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用研究

吳 洋，王 洋，馬學琴

(1.寧夏醫(yī)科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學 回藥現代化工程技術研究中心，寧夏 銀川 750004；3.銀川市口腔醫(yī)院，寧夏 銀川 750004)

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苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用研究

吳 洋1,2，王 洋3，馬學琴1,2

(1.寧夏醫(yī)科大學 藥學院，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學 回藥現代化工程技術研究中心，寧夏 銀川 750004；3.銀川市口腔醫(yī)院，寧夏 銀川 750004)

目的：研究苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用并初步探討其機制。方法：采用♂昆明小鼠隨機分為正常對照組、模型組、陽性對照(硫普羅寧30 mg/kg)組、苦參堿高、中、低劑量(80 mg/kg、40 mg/kg和20 mg/kg)組，分別灌胃給藥6天，于第6天末次給藥2h后除正常對照組外，其余各組一次性灌胃給予50%乙醇(5 g/kg)。乙醇處理12h后測定血清谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)的活性及肝臟組織勻漿丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽還原酶(GSH-px)的含量，并進行肝組織病理學切片檢查及Ridit分析。結果：與模型組比較，苦參堿各劑量組血清AST、ALT活力和肝組織MDA含量顯著降低(P<0.05)；肝組織SOD、GSH-Px 活力均升高(P<0.05)；苦參堿高、中劑量組R值顯著于模型組(P<0.05)。結論：苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷具有保護作用，其保護作用可能與抗氧化應激相關。

苦參堿；酒精；急性肝損傷；谷草轉氨酶；谷丙轉氨酶；氧化應激

酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是長期過度飲酒導致的肝臟疾病，是肝硬化的最主要病因之一[1]。隨著近年來我國飲酒人群不斷增加，ALD的發(fā)病率和死亡率也逐年增高，已成為繼病毒性肝炎之后的第二大肝病[2]。目前，ALD的治療仍然是以戒酒為主，尚無特效藥物，且支持治療作用有限。尋找預防和治療酒精性肝損傷的藥物已成為國內外研究的熱點之一?？鄥A(matrine)是從寧夏特色回藥材苦豆子(SophoraalopecurodiesL)中提取的主要生物堿之一，具有諸多藥理作用。研究表明，苦參堿對內毒素和缺血再灌注致肝損傷具有保護作用[3]。酒精可參與肝細胞中氧化應激反應，其在肝中的過量代謝可產生大量自由基，促進肝細胞的脂肪變性、壞死和炎細胞浸潤從而導致肝損傷[4]。酒精所致肝損傷的機制與乙醇及其代謝產物對肝細胞的氧化損傷和降低抗氧化物水平有關[5-6]。本研究旨在觀察苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷的保護作用及初步作用機制，為其防治急性酒精性肝損傷提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物

清潔級♂昆明種小鼠共60只，體重18～22g，由寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(寧)2011-0003。

1.2 試劑

苦參堿(寧夏紫荊花藥業(yè)有限公司，純度99.8%，批號90110301)；硫普羅寧( 河南省新誼藥業(yè)股份有限公司，批號100909)；50%乙醇(分析純，天津基準化學試劑有限公司，批號20101020)；谷丙轉氨酶(ALT) 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20110316)；谷草轉氨酶(AST) 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20110309)；丙二醛(MDA) 試劑(南京建成生物工程研究所，批號20110309)；超氧化物歧化酶(SOD) 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20110315); 谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px) 試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20110307); 考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20110303);冰醋酸(北京化工廠，批號20081018)。

1.3 儀器

VIS-7220N 可見分光光度儀(北京中西遠大科技有限公司)；低溫超速離心機(日本東京Hongo . BUNKYO-KU)；SHHW21三用電熱恒溫水浴箱(北京長遠實驗設備廠)；MERRLERAE240型電子分析天平(梅特勒-托利儀器上海有限公司)。

2 方法

2.1 造模及給藥

60只♂昆明小鼠，適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組、模型組、陽性對照(硫普羅寧30 mg/kg)組、苦參堿高、中、低劑量(80 mg/kg、40 mg/kg和20 mg/kg)組。正常組和模型組給予蒸餾水，陽性藥物組和苦參堿各劑量組給予對應劑量藥物灌胃，每天灌胃1次，連續(xù)6天。根據文獻[7]，于第6天灌胃2h后，模型組、陽性對照組及苦參堿各劑量組一次性灌胃給予體積分數為50%乙醇(分析純，以蒸餾水稀釋)，灌胃量為12.5mL/kg，折合乙醇劑量為5g/kg[乙醇劑量(g/kg)=乙醇密度(0.8g/mL)×乙醇體積(12.5mL/kg)×乙醇濃度]，正常組給予蒸餾水灌胃。

2.2 樣本采集及指標檢測

小鼠于末次給藥后禁食12 h，自由飲水。采用眼球后靜脈叢取血法獲得血標本后于4℃靜置2 h，1 500 r /min 離心10 min，取上清液測定ALT、AST 活性;取肝組織約0.3g，剪碎后按1∶9比例加入生理鹽水，冰浴中制備肝臟組織勻漿，測定肝勻漿中MDA 含量以及SOD、GSH-Px 活性。同時取肝左葉距邊緣0.5cm 處的一小塊肝組織，用10% 甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，行HE 染色，光鏡下觀察肝組織脂肪變性程度和炎癥、壞死情況。依據中華醫(yī)學會肝臟病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組《酒精性肝病診療指南：2010年1月(修訂)》進行肝臟脂肪變性評分分級[8]。按肝細胞脂肪變性占所獲取肝組織標本量的范圍，分為4度(F0-4)：F0:<5%的脂肪細胞脂肪變性；F1:5%～30%的肝細胞脂肪變性；F2:31%～50%的肝細胞脂肪性變；F3:51%～75%的肝細胞脂肪變性；F4:>75%的肝細胞脂肪變性。

2.3 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 苦參堿對急性酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST 活性的影響

模型組血清ALT、AST 活性較正常對照組明顯增加(P<0.01)，苦參堿可明顯降低模型小鼠血清ALT、AST 活性(P< 0.05，P<0.01) 。具體見表1。

表1 苦參堿對急性酒精性肝損傷小鼠血清ALT、AST的影響 (n=10,±s)

注：與正常對照組比較,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01。

3.2 苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷肝組織MDA、SOD、GSH-Px活性的影響

模型組肝組織MDA含量較正常對照組明顯增加(P<0.01)，SOD 和GSH-PX 活性較正常對照組顯著降低(P<0.01)，苦參堿各劑量組可明顯降低模型小鼠肝組織MDA含量(P<0.01)，中、高劑量組可明顯提高模型小鼠肝組織SOD、GSH-Px 活性(P<0.01)。見表2。

表2 苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷肝組織MDA、SOD、GSH-Px活性的影響 (n=10,±s)

注：與正常對照組比較，**P<0.01;與模型組比較，##P<0.01。

3.3 苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷肝組織病理變化的影響

光鏡下，正常對照組可見肝小葉及肝細胞結構完整，肝細胞條索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，界限清晰，病理脂肪變?yōu)镕0度。模型組肝小葉結構模糊，肝索排列紊亂，肝細胞腫脹明顯，胞漿透明，胞質疏松，可見圓形脂肪空泡幾乎占據所有肝組織及炎細胞浸潤，局部細胞核溶解壞死，病理脂肪變以F4度為主?？鄥A低劑量組肝小葉結構尚存在，其中可見局部脂肪空泡，肝細胞腫脹減輕，脂肪變以F2和F3度為主?？鄥A中、高劑量組小鼠肝小葉基本正常，肝竇輪廓整齊，細胞分界清晰，肝細胞無明顯空泡及疏松，少見炎細胞浸潤，脂肪變?yōu)镕1和F2度。由于病理多分類變量按F0-F5度由輕到重排列，Ridit平均值低于0.05，表示病理變化較輕。統(tǒng)計結果顯示苦參堿高、中劑量組小鼠肝損傷程度較模型組均有所減輕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示苦參堿可以減輕乙醇致小鼠急性肝損傷。見圖1和表3。

圖1 苦參堿對小鼠急性酒精性肝損傷肝組織病理變化的影響(×40)

組別劑量(mg/kg)數量脂肪變積分F0(<0．5%)F1(5%～30%)F2(31%～50%)F3(51%～75%)F4(>75%)R值正常對照組—101000000．083##模型組—10000370．862苦參堿(Matrine)8010044200．453##4010034210．518#2010005320．653陽性對照組(硫普羅寧)3010053200．430##總計—6010121612100．500

注：與模型組比較，#P<0.05,##P<0.01。

4 討論

酒精性肝病(ALD)是全球范圍內影響人類健康的重要疾病，短時間內大量攝入乙醇可導致肝臟發(fā)生嚴重損傷，即急性酒精性肝損傷[9]。本實驗采用50%乙醇灌胃誘發(fā)小鼠急性肝損傷模型，該模型與人急性酒精性肝損傷相似[7]。動物體內ALT和AST是肝細胞內主要功能酶，它們廣泛存在于肝細胞中，當肝組織損傷及壞死時，肝細胞膜和細胞器結構被破壞，膜流動性失常，酶從細胞釋放入血，血清中ALT、AST含量就會升高，故ALT、AST的高低可用來判斷其肝損傷的程度[10]。本實驗結果表明，苦參堿可使乙醇致急性肝損傷小鼠血清ALT、AST水平顯著降低。說明苦參堿對乙醇致急性肝損傷小鼠肝功能具有一定保護作用。

研究表明，乙醇誘導的急性肝損傷機制與乙醇及其代謝產物引起的氧化應激密切相關，被認為是最重要的發(fā)病機制之一[5,6,11]。氧化應激主要是過多氧自由基(ROS)與抗氧化酶系統(tǒng)(SOD和GSH-px等)的不平衡所致?？寡趸傅幕钚苑从硻C體對氧自由基清除能力的高低，故可通過提高機體抗氧化酶活性，來減少氧自由基的增多以抑制氧化應激反應。而增多的氧自由基與生物大分子發(fā)生脂質過氧化反應，造成生物膜損傷并使產生的過氧化物丙二醛(MDA)的含量升高。MDA是脂質過氧化反應的終產物，其含量高低也能夠在一定程度上反映肝臟受損情況[11-12]。肝臟是乙醇代謝的主要場所，飲酒后約90%的乙醇由肝臟的乙醇代謝系統(tǒng)，即乙醇脫氫酶(ethanol dehydrogenase, ADH)和乙醇氧化系統(tǒng)(microsomal ethanol oxidizing system, MEOS)代謝清除。體內乙醇大部分由ADH代謝轉化為乙醛，再由乙醛脫氫酶(acetaldehyde dehydrogenase，ALDH)催化生成無毒的乙酸，最終進入三羧酸循環(huán)生成能量、CO2和H2O。而乙醛轉化為乙酸的速度較慢，容易蓄積在體內。乙醛可與肝細胞中蛋白、DNA形成加合物影響蛋白質的變構，使酶失活使肝細胞功能受損[13]。同時乙醛也可通過黃嘌呤氧化酶轉變?yōu)槌趸锖脱踝杂苫?，使機體ROS增多，引發(fā)氧化應激，導致MDA增高，SOD、GSH-px大量消耗，肝臟清除自由基能力下降[14]。由此可見，氧化應激及脂質過氧化受阻在酒精性肝損傷的過程中意義重大，而維持機體內SOD和GSH-px的活性，就能夠清除代謝產生的多量自由基，進而保護肝臟。因此，維持機體氧化-抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡至關重要。本實驗結果表明，模型組與正常組比較，血清ALT、AST活性明顯增加，而肝臟組織SOD及GSH-px明顯降低，MDA增多。說明急性酒精性肝損傷小鼠模型的建立是成功的。而苦參堿各劑量組和模型組比較，血清ALT、AST活性明顯降低，肝臟組織SOD和GSH-px活性增加， MDA含量降低，表明苦參堿可通過提高肝臟組織中SOD及GSH-px活性，降低肝細胞內的ROS，從而穩(wěn)定細胞膜，降低血清中轉氨酶含量，進而減輕肝損傷，保護肝細胞。此外，組織病理學結果也表明苦參堿各組肝小葉及肝細胞病理改變較模型組明顯好轉，說明苦參堿可減輕乙醇致小鼠急性肝損傷。

綜上所述，苦參堿對乙醇致小鼠急性肝損傷具有保護作用，其機制與降低血清ALT、AST和肝臟組織中MDA含量，增加肝臟組織中SOD及GSH-px活性及抗氧化應激有關。

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(責任編輯：宋勇剛)

Protective Effects of Matrine on Acute Ethanol-Induced Liver Injury in Mice

Wu Yang1,2,Wang Yang3, Ma Xueqin1,2

(1.Department of Pharmacology, NingXia Medical University, Ningxia 750004, China;2.Ningxia Engineering & Technology Research Center for Modernization of Hui Medicine, Ningxia 750004, China;3.Yinchuan Stomatology Hosptial, Ningxia 750004 China)

Objective:To investigate the protective effect of matrine on acute ethanol-induced liver injury in mice and its mechanism. Methods:Male Kunming mice were randomLy divided into the control group, model group, positive control group (Tiopronin) and different concentration of matrine (80 mg/kg, 40 mg/kg and 20 mg/kg) and irrigation stomach respectively for 6 days. The mice were induced alcohol acute liver damage by ethanol (50%，5 g/kg) at the last administration beside control group. After 12 hours ethanol treatment, the determination serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT); MDA, SOD and GSH-px in liver tissue were detected. Pathological changes in liver tissue were checked by the Ridit analysis method.Results:The determination of liver index, activity of serum AST and ALT and MDA in liver tissue homogenate were significantly reduced(P<0.05)and the activity of SOD and GSH-px in liver tissue were increased(P<0.05) in each dose of matrine. The value of R in matrine high and middle doses were decreased (P<0.05). Conclusion:Matrine has a significant protection against acute ethanol induced hepatic injury, and the mechanism may be associated with anti-oxidative activities.

Matrine; Ethanol; Acute Liver Injury; AST; ALT; Oxidative Stress

2014-07-23

寧夏醫(yī)科大學科學研究基金資助面上項目(XM200910)

吳洋(1979-)，女，博士，寧夏醫(yī)科大學講師，研究方向為細胞分子藥理學。E-mail: charming_wuyang@163.com。

R285

A

1673-2197(2014)19-0006-03