射干不同采收期黃酮類成分的動態(tài)變化規(guī)律*

普冰清，朱艷**，許方云，李鋆，秦民堅**

中國藥科大學(xué) 1中藥資源學(xué)教研室；2天然藥物活性成分與藥效國家重點實驗室，南京 210009

射干不同采收期黃酮類成分的動態(tài)變化規(guī)律*

普冰清1，2，朱艷1，2**，許方云1，李鋆1，秦民堅1，2**

中國藥科大學(xué)1中藥資源學(xué)教研室；2天然藥物活性成分與藥效國家重點實驗室，南京 210009

為確定射干最佳采收年限和最佳采收時間，應(yīng)用HPLC法測定二年生和三年生栽培射干春、秋季不同采收時間中12種黃酮類成分含量的動態(tài)變化。結(jié)果顯示：以黃酮類活性成分作為指標，在南京栽培的射干以二年生采收較優(yōu)，時間以春季5月上、中旬采收時間最佳。

射干；高效液相色譜；黃酮類含量；最佳采收年限；采收期

射干Belamcanda chinensis（L.）DC.為鳶尾科射干屬植物，以根莖入藥。我國射干屬僅1種，分布于全國各省，主產(chǎn)湖北、河南、江蘇和安徽等地。射干首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，歷版《中國藥典》都有收載；該藥材能清熱解毒、消痰、利咽[1]。有研究表明，射干的有效成分主要是黃酮類化合物，鳶尾苷及其苷元具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗病原微生物等作用[2]。據(jù)本課題組前期研究，栽培于南京的射干黃酮類成分含量春季和秋季都有一個高峰期[3-4]；但由于當時所測的成分數(shù)量有限及方法的局限性，不能完全反映該中藥材的質(zhì)量變化。因此，在前期研究工作的基礎(chǔ)上，本研究把射干春、秋適宜采收期中的取樣時間點細化為每月三次，采用HPLC法同時對在南京栽培的二年和三年生射干春、秋季不同采收期的12種黃酮類成分進行含量測定，研究其動態(tài)變化規(guī)律，以確定射干的最佳采收期，并為射干的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100系列高效液相色譜儀，UV檢測器，Agilent色譜工作站；Sartorius CPA224S分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；QE-100藥材粉碎機（武義縣屹立工具有限公司）；LGJ-18S冷凍干燥機（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）。

1.2 藥材與試劑

二年生及三年生射干根莖采自中國藥科大學(xué)藥用植物園，經(jīng)本文作者之一秦民堅教授鑒定為鳶尾科植物射干Belamcanda chinensis（L.）DC.。

新芒果苷（neomangiferin，1）、芒果苷（mangiferin，2）、鳶尾苷（tectoridin，3）、鳶尾新苷B（iristectorin B，4）、鳶尾新苷A（iristectorin A，5）、野鳶尾苷（iridin，6）、鳶尾黃素（tectorigenin，7）、鳶尾甲黃素A（iristectorigenin A，8）、野鳶尾黃素（irigenin，9）、次野鳶尾黃素（irisflorentin，10）、德鳶尾素（irilone，11）和白射干素（dichtomitin，12）對照品，均為本實驗室自制，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR鑒定和HPLC法檢測，純度均＞98%；色譜級乙腈（Merk，Germany）。

2 方法

2.1 采收時間

分別于2012年春季4、5月和秋季9、10、11月，每月的5、15、25日采收實驗樣品；采用對角線取樣法，在試驗田中按對角線選定5個取樣點，每個取樣點上隨機挖取1株。采集植物樣品后去泥，洗凈，剪去須根及地上部分，取其根莖，切片，冷凍干燥，取出置于干燥器中回升至室溫，粉碎，過60目篩，過篩粉末作為實驗樣品。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取適量新芒果苷（1）、芒果苷（2）、鳶尾苷（3）、鳶尾新苷B（4）、鳶尾新苷A（5）、野鳶尾苷（6）、鳶尾黃素（7）、鳶尾甲黃素A（8）、野鳶尾黃素（9）、次野鳶尾黃素（10）、德鳶尾素（11）、白射干素（12）對照品，用75%甲醇溶解并定容至1 mL，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

精密稱取射干樣品粉末（過60目篩）0.10 g于離心管中，加入75%甲醇10 mL，超聲提取30 min，3000 r·min-1離心5 min，上清液移入25 mL量瓶中，殘渣再重復(fù)提取一次，合并上清液，冷卻至室溫后用75%甲醇定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 色譜條件

建立了同時測定射干中12種黃酮類成分的方法。色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；預(yù)柱：Alltech C18guard column（7.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（B）及0.4%冰醋酸（A），梯度洗脫（見表1）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：269 nm；柱溫：30℃；進樣量：20 μL。對照品及樣品的高效液相色譜見圖1。

表1 洗脫梯度條件

圖1 對照品及樣品高效液相色譜圖

2.5 標準曲線制備

分別精密吸取混合對照品溶液6個不同體積，置量瓶中，75%甲醇定容至刻度，進樣20 μL，測定。以峰面積Y為縱坐標，濃度X（μg·mL-1）為橫坐標，繪制標準曲線，回歸方程見表2。

2.6 精密度試驗

取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定其日內(nèi)精密度；連續(xù)6天進樣，測定其日間精密度。日內(nèi)精密度小于2.20%，日間精密度小于3.60%，說明儀器的精密度良好。

表2 射干根莖中黃酮類成分標準曲線

2.7 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液（2012年9月5日采集的二年生射干樣品），分別于0、3、6、12、24 h測定。RSD均小于4.00%，說明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗

精密稱取同一供試品射干根莖粉共6份，按“2.3”項下方法制備溶液，分別進樣，記錄峰面積，計算12種成分含量，RSD均小于4.10%，說明方法重復(fù)性好。

2.9 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的供試品0.05 g制備供試品溶液，加入已知濃度的混合對照品溶液適量，制備3份，分別測定加樣回收率。12種對照品的加樣回收率為96.75%～101.39%，說明加樣回收率良好。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品含量測定

分別精密稱取樣品粉末0.10 g。按“2.3”項下制備供試品溶液，按“2.4”項下色譜條件進樣分析，分別測定樣品中各黃酮類成分含量（每份樣品3次重復(fù)，計算Mean和SD值），見圖2和圖3。

3.2 不同采收期黃酮類成分含量的動態(tài)變化

由圖2可知，不同生長年限射干在春、秋季不同采收期，其總黃酮含量變化趨勢基本相似。

圖2 不同采收期總黃酮含量動態(tài)變化圖

圖3 不同采收期12種黃酮類成分含量動態(tài)變化

射干中黃酮苷及苷元的變化趨勢基本一致，均表現(xiàn)為春季采收期含量高于秋季采收期，其中春季采收期二年生和三年生射干以5月上旬和中旬含量最高。秋季采收期，二年生射干中黃酮苷含量于9月末達到最高，黃酮苷元含量于10月初達到最高；三年生射干中黃酮苷和苷元含量均于11月初達到最高。

有研究表明，射干中的鳶尾苷、鳶尾黃素、野鳶尾苷元和芒果苷具有抗炎作用[5]，鳶尾新苷A和鳶尾新苷B也具有清除氧自由基活性[6]。同時，鳶尾苷、鳶尾新苷A、鳶尾新苷B和野鳶尾苷為射干中的主要成分，而次野鳶尾黃素是《中國藥典》規(guī)定指標成分（≥0.01%）。因此，本文重點對芒果苷、鳶尾苷、鳶尾黃素、鳶尾新苷A、鳶尾新苷B、野鳶尾苷、野鳶尾黃素和次野鳶尾黃素在采收期中的含量動態(tài)變化進行分析。

由圖3和表3可知，二年生射干中，次野鳶尾黃素和白射干素成分，春季含量高，4月5日達最高值，其后含量有所回落，4月25日含量有所回升，5月其含量變化比較平穩(wěn)，9月初這兩種成分從較低的含量逐漸回升，9月下旬至10月中旬其含量變化比較平穩(wěn)，10月末和11月含量又逐漸降低。芒果苷于4月初開始含量逐漸增加，至4月25日達到含量最高值后開始逐漸降低，至5月底到達含量最低值；9月芒果苷含量變化較平穩(wěn)，至10月初達到秋季最高值后，含量逐漸下降。鳶尾黃素、野鳶尾黃素、鳶尾甲黃素A和新芒果苷于4月含量先下降至5月初含量驟然升高，5月15日達到高峰值之后又驟然降低，9月初從含量最低值逐漸回升，于10月上旬達到秋季高峰后又緩慢降低。鳶尾苷、鳶尾新苷B、鳶尾新苷A、野鳶尾苷和德鳶尾素在春季采收期，含量逐漸升高，均于5月5日達到最高值，之后含量下降，它們的含量在秋季采收期變化較穩(wěn)定。

圖3和表3表明，三年生射干中，鳶尾苷、鳶尾黃素、新芒果苷、鳶尾新苷A、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素、鳶尾甲黃素A、德鳶尾素和白射干素成分含量春季4月含量變化較平穩(wěn)，5月含量顯著增加，于5月5日達到最高值后含量逐漸下降；芒果苷含量5月時含量較高，其后有所下降，于10月5日達到最大值后緩慢降低；鳶尾新苷B含量較穩(wěn)定，于5月15日達到最大；野鳶尾苷含量在春季含量較高，變化比較平穩(wěn)，于5月15日達到最大值后又降低，秋季于11月5日又出現(xiàn)高峰，之后迅速降低。

3.3 不同生長年限射干主要黃酮類成分含量比較

通過比較不同生長年限射干各種黃酮類成分含量最大值（見表3），表明二年生射干中芒果苷、鳶尾苷、鳶尾新苷B、鳶尾新苷A、野鳶尾苷、鳶尾黃素、鳶尾甲黃素A和白射干素含量高于三年生；三年生射干中新芒果苷、野鳶尾黃素、次野鳶尾黃素和德鳶尾素含量高于二年生。二年生射干中總黃酮苷類成分含量顯著高于三年生，而總黃酮苷元三年生的較高。由于黃酮苷類成分為總黃酮中的主要成分，從而二年生射干中總黃酮類成分含量較三年生高。通過以上分析表明，二年生射干中大部分黃酮類成分含量較三年生的高，二年生射干質(zhì)量相對高于三年生射干。

4 結(jié)論

黃酮類成分作為射干根莖中的主要有效成分，其含量高低決定著射干藥材的質(zhì)量，隨著射干生長發(fā)育階段的自然條件更迭，其體內(nèi)黃酮類成分的含量會隨之發(fā)生動態(tài)變化[3-4]。經(jīng)過冬季的休眠期，4月份射干越冬芽開始展葉和轉(zhuǎn)綠[7]，此時，射干的地上和地下器官的生理活動逐漸加強，黃酮類成分逐漸增加。5月初，隨著溫度逐漸增高，射干植株生長迅速，與此同時，根莖內(nèi)黃酮類成分含量達到最大值。射干5月中旬開始抽出地上莖，植株迅速長高，從營養(yǎng)生長向生殖發(fā)育過渡，根莖內(nèi)的黃酮類成分含量從最高點逐漸下降。6～8月為射干花期，9月果實開始成熟，果期持續(xù)一個月左右，9月末至10月初，射干種子成熟并開始散落，10月地上部分逐漸枯萎，10月下旬地上部分開始倒伏，此時，射干根莖中黃酮類成分含量較高且穩(wěn)定。11月中旬射干地上部分均枯萎，此時，二年生射干根莖內(nèi)黃酮類成分含量均最低。射干黃酮類成分含量春季和秋季都有一個高峰期，這與傳統(tǒng)上根及根莖類藥材適宜在春秋兩季采挖的理論相吻合[8]。隨著生長年限的延長，三年生射干根莖的生理活性有所降低，大部分黃酮類成分含量有所下降，但幅度不大。因此，射干的采收年限應(yīng)綜合射干的生物學(xué)性狀、有效成分含量和經(jīng)濟效益等因素考慮。建議以采收生長二年者為佳，采收時間以春季5月中上旬抽出地上莖前，秋季以10月果實成熟，種子脫落后采收為宜，其中又以5月中上旬抽出地上莖前采收為最佳選擇。

表3 不同生長年限射干中黃酮類成分最高含量比較

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Chronological Variation Patterns of Flavonoid Contents in the Rhizomes of Belamcanda*

PU Bing-qing1,2,ZHU Yan1,2**,XU Fang-yun1,LI Jun1,QIN Min-jian1,2**
1Department of Resources Science of Traditional Chinese Medicines;2State Key Laboratory of Natural Medicines,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China

To determine the optimum harvesting age and time for rhizomes ofBelamcanda chinensis(L.)DC.,contents of twelve flavonoids in the biennial and triennial rhizomes ofB.chinensis(L.)DC.from different sampling points during the spring and autumn of 2012 were analyzed by an HPLC method.In conclusion,taking the flavonoids contents as index,the optimum harvesting time for rhizomes of B.chinensis cultivated in Nanjing should be in May(before terrestrial stems growing)and the optimum harvesting age should be biennial.

Belamcanda chinensis(L.)DC.;High performance liquid chromatography;Flavonoids contents;Optimum harvesting age;Optimum harvesting time

R284.1

A

1673-7806（2014）03-212-04

國家自然科學(xué)基金項目（81373918）；國家“十二五”規(guī)劃科技重大專項創(chuàng)新藥物研究（2012ZX09304006）；中央高?？蒲袠I(yè)務(wù)費（JKQ2011038）

普冰清，女，碩士生 E-mail:kypbq@163.com

**通訊作者 秦民堅，男，博士，教授，研究方向：中藥資源與開發(fā) E-mail:minjianqin@163.com；朱艷，女，博士，研究方向：藥用植物種質(zhì)資源與生物技術(shù) E-mail:cpuzy@126.com

2014-02-26

2014-03-07