蘆薈大黃素對人永生化角質(zhì)形成細胞增殖和凋亡作用研究

曾德貴 ，莫衍石 ，劉榮豐 ，楊春燕 ，林世平 ，陳小誼 ，蘭柳波

（1.廣東省深圳市慢性病防治中心，廣東 深圳 518020； 2.廣東醫(yī)學院生物化學與分子生物學研究所，廣東 湛江 524023）

蘆薈（aloe）屬多年生常綠肉質(zhì)草本植物，具有很高的藥用價值，性苦、寒，可清肝熱、通便[1]。現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，蘆薈的藥用有效成分十分復(fù)雜，主要有大黃素、大黃酚、蒽醌等物質(zhì)，其中起抑菌作用的成分主要是蘆薈大黃素生物活性物質(zhì)[2]。銀屑病是由于角質(zhì)形成細胞過度增殖引起的一種具有遺傳傾向的炎癥性增殖性皮膚病，臨床缺乏有效的治療藥物。目前尚未見關(guān)于蘆薈用于臨床治療銀屑病的報道，但有研究報道了蘆薈對銀屑病患者外周血單核細胞和角質(zhì)形成細胞增殖的影晌[3-5]。人永生化角質(zhì)形成細胞HaCaT是一種永生化的角質(zhì)形成細胞株，具有永生性和與角質(zhì)形成細胞相似的增殖、分化特性，遺傳特性穩(wěn)定，不具有成瘤性，常用來替代人表皮角質(zhì)形成細胞進行研究[6]，是研究藥物治療銀屑病療效常用的體外細胞模型。本研究中擬從蘆薈中提取蘆薈大黃素，檢測其對HaCaT細胞增殖能力、細胞形態(tài)、細胞周期及凋亡的影響，從而為蘆薈治療銀屑病提供藥理學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（EYELA，上海愛朗儀器有限公司）；全自動酶標儀、低速離心機（美國Sigma公司）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；流式細胞儀（美國BD公司 FAC scalibur流式細胞儀）；CO2細胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）。蘆薈采自廣東徐聞縣境內(nèi)；對照品蘆薈大黃素購自中國藥品生物制品檢定所（787-9001）。人角質(zhì)形成細胞（HaCaT細胞）購自中國典藏培養(yǎng)物保藏中心。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購自美國Gibco公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶(Gibco公司)。PI染色試劑盒（聯(lián)科生物）。

1.2 方法

1.2.1 蘆薈大黃素的提取與制備

取中藥材蘆薈約100 g，洗凈、粉碎、酸化后風干，用本課題組建立的工藝路線提取得到蘆薈大黃素提取物。經(jīng)鑒定，其成分的分子結(jié)構(gòu)與對照品蘆薈大黃素一致。用DMSO溶解配制成質(zhì)量濃度為 10 g/L的蘆薈大黃素提取物藥液，用 0.22μm微孔濾膜過濾除菌，試驗前用細胞培養(yǎng)液稀釋成所需質(zhì)量濃度，DMSO終濃度小于或等于 0.1%（V/V）。試驗表明，該濃度對細胞生長無影響。

1.2.2 細胞培養(yǎng)

將 HaCaT細胞以5×105個/mL接種于含 10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置37℃及5%CO2培養(yǎng)箱。在細胞數(shù)達1×109/mL前用完全培養(yǎng)基重新懸浮，并以1∶3的比例傳代，取對數(shù)生長期細胞進行試驗。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期 HaCaT細胞，以2.0×104mL接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL；接種24h后分別加入不同質(zhì)量濃度藥物，使蘆薈大黃素終質(zhì)量濃度分別為20，40，80μg/mL，每個質(zhì)量濃度設(shè)3～5個平行孔，并設(shè)空白對照組、溶劑對照組；給藥48 h后，每孔加入 20 μLMTT（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗板1次，再加入 DMSO，每孔 100μL，室溫震蕩搖勻10 min，用酶標儀在492 nm波長處測定吸光度（OD）值，并計算增殖抑制率。抑制率（%）＝（1-給藥組 OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.4 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化

取對數(shù)生長期細胞，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶，當細胞長滿培養(yǎng)瓶底約60%時置于光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)后加藥。設(shè)空白對照組，培養(yǎng)24 h后，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并作記錄。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測蘆薈大黃素對HaCaT細胞周期的影響

取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的HaCaT細胞，制成單個細胞懸液，以每孔約104個細胞接種于6孔培養(yǎng)板上，待細胞生長融合到70%～80%時，加入不同質(zhì)量濃度的蘆薈大黃素，每個藥物質(zhì)量濃度設(shè)3個平行孔。作用48 h后用胰酶消化，收集細胞，并用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞兩次后用100μL無血清培養(yǎng)基重懸細胞，加入預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定。上機前離心，去上清，并用PBS 5 000 r/min洗滌細胞2次，每次5 min。分別在每個樣品中加入100μL RNaseA，于37℃溫水中水浴30 min后加入PI進行染色，4℃避光30min后，上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 蘆薈大黃素對HaCaT細胞增殖的影響

MTT檢測結(jié)果顯示，蘆薈大黃素可顯著抑制體外培養(yǎng)的Ha-Cat細胞的生長，且隨著藥物質(zhì)量濃度增加抑制作用增強，即呈一定范圍的劑量依賴性，見表1?？梢姡煌|(zhì)量濃度藥物組吸光度明顯減少，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 蘆薈大黃素作用于HaCaT細胞48 h的抑制效應(yīng)（±s，n＝3）

表1 蘆薈大黃素作用于HaCaT細胞48 h的抑制效應(yīng)（±s，n＝3）

組別對照組0.1%D M S O 組低劑量組中劑量組高劑量組質(zhì)量濃度（ g/mL）--2 0 4 0 8 0 O D 492 2.3 0 ± 0.1 2 2.3 4 ± 0.0 8 1.9 1 ± 0.1 7 0.9 0 ± 0.1 8 0.7 6 ± 0.1 5抑制率（%）0.0 0-2.0 0 1 6.9 5 6 0.0 8 6 6.9 5

2.2 細胞形態(tài)學觀察

在倒置顯微鏡下觀察，空白對照組細胞數(shù)量多，密度大，細胞呈梭形或不規(guī)則形，折光性強；經(jīng)一定質(zhì)量濃度蘆薈大黃素處理后細胞數(shù)量明顯減少，細胞體積變小、變形，出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落，細胞折光性減低。

2.3 細胞凋亡的流式細胞儀分析

不同質(zhì)量濃度的蘆薈大黃素作用于HaCaT細胞48 h后，S期細胞與對照組相比明顯增加，G0/G1期比例降低，可見藥物將細胞阻滯于S期。見表2。

表2 蘆薈大黃素作用于HaCaT細胞48 h后對細胞周期的影響（±s，n＝3）

表2 蘆薈大黃素作用于HaCaT細胞48 h后對細胞周期的影響（±s，n＝3）

注:與對照組相比，P ＜0.05。

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組質(zhì)量濃度（ g/mL）-2 0 4 0 8 0 G 0/G 1 2 5.8 1 3.7 1 5.4 1 1.6 S 5 0.3 6 4.0 5 9.1 7 2.5 G 2/M 2 3.8 2 2.4 2 5.5 1 6.0

3 討論

銀屑病是常見慢性炎癥性皮膚病，頑固且易復(fù)發(fā)。研究表明，銀屑病大多表現(xiàn)為角質(zhì)形成細胞過度增殖及異常分化。細胞凋亡與增殖是生物體內(nèi)一對并存的矛盾，正常情況下二者維持動態(tài)平衡，因而細胞凋亡與增殖變化緊密相關(guān)。多數(shù)學者認為，銀屑病患者皮損中角質(zhì)形成細胞的凋亡受阻，在銀屑病中表達異常，并且與銀屑病角質(zhì)形成細胞過度增生、炎癥細胞浸潤有關(guān)。在銀屑病發(fā)病相關(guān)的角質(zhì)形成細胞凋亡研究中，一般均使用HaCat細胞作為正常角質(zhì)形成細胞模型[7]。本研究中，采用體外培養(yǎng)的HaCaT細胞，研究蘆薈大黃素對HaCaT細胞增殖能力的影響，試驗分別采用MTT法檢測細胞生長狀況、倒置顯微鏡進行形態(tài)學觀察，以及流式細胞儀檢測細胞周期。細胞的增殖力、形態(tài)、細胞周期3個方面變化的結(jié)果表明，蘆薈大黃素對HaCaT細胞的作用具有一定范圍內(nèi)的劑量依賴關(guān)系，但這種依賴并非簡單線性關(guān)系，而是呈現(xiàn)出隨機非線性的特點。在低質(zhì)量濃度藥物時幾乎不影響HaCaT細胞生長，但用高質(zhì)量濃度藥物處理細胞后，其生長受到明顯抑制，甚至出現(xiàn)大部分凋亡、裂解成碎片的現(xiàn)象。

采用流式細胞術(shù)對細胞周期的研究結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的蘆薈大黃素均能降低細胞G1期時相的比例，使S期時相的比例上升，而將細胞阻滯于S期(即DNA合成期)，即其可能通過阻止細胞的DNA合成來抑制細胞增殖，從而抑制細胞有絲分裂并誘導(dǎo)其凋亡。

綜上所述，蘆薈大黃素質(zhì)量濃度在20～80μg/mL范圍內(nèi)能明顯抑制HaCaT細胞的增殖，且抑制能力隨藥物質(zhì)量濃度升高而增強；并可通過將細胞阻滯于S期誘導(dǎo)其凋亡。此作用機理為應(yīng)用蘆薈大黃素治療提供了藥理學依據(jù)，但由于體內(nèi)外試驗的差異，其臨床治療銀屑病的機制尚需進一步的研究。

參考文獻:

[1]國家藥典委員會.中國人民共和國藥典（一部）[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:151.

[2]李志富，邵 偉，丁 靜，等.蘆薈植物提取液抑菌效果及毒性試驗研究[J].中國消毒學雜志，2008，25（4）:384-385.

[3]朱可建，周偉芳，勞力民，等.銀屑病患者外周血單核細胞向樹突狀細胞分化能力的研究[J].中華皮膚科雜志，2002，35（2）:88-90.

[4]徐麗敏，李 虹，毛舒和，等.蘆薈對銀屑病患者外周血單一核細胞產(chǎn)生干擾素- 的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學雜志，2003，2（3）:162-163.

[5]徐麗敏，王彥紅，李 虹，等.蘆薈對銀屑病患者外周血單核細胞和角質(zhì)形成細胞增殖和凋亡的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學雜志，2005，4（4）:123-125.

[6]余靖宏，趙瑞芝，盧傳堅.銀屑靈優(yōu)化方對銀屑病豚鼠及炎性刺激角質(zhì)形成細胞增殖的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28（5）:1 531-1 534.

[7]陳小娥，駱 丹.角質(zhì)形成細胞的凋亡失調(diào)及相關(guān)皮膚病[J].國際皮膚性病學雜志，2007，33（2）:101-103.