漢桃葉總黃酮的提取及其鎮(zhèn)痛抗炎活性研究

黃 婧 ,馬健雄

（1.廣西壯族自治區(qū)桂林市第二人民醫(yī)院藥劑科,廣西 桂林 541001； 2.廣西醫(yī)科大學(xué),廣西 南寧 530021；3.廣西金海堂藥業(yè)有限責(zé)任公司新藥研發(fā)中心,廣西 南寧 530313）

漢桃葉,又名七加皮,為五加科植物廣西鵝掌藤 Schefflera arboricola Hayata的干燥莖枝或帶葉莖枝,性味微苦、溫,為廣西特色藥材,具有祛風(fēng)活絡(luò)、消腫止痛等功效[1]。在壯族醫(yī)藥中,常用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病。漢桃葉有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌等作用[2],但其鎮(zhèn)痛抗炎活性物質(zhì)并未明確。為此,筆者系統(tǒng)研究了漢桃葉黃酮類化合物的提取工藝,并對(duì)其鎮(zhèn)痛、抗炎作用進(jìn)行了測(cè)試,為漢桃葉的深度開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TV-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京醫(yī)療設(shè)備廠有限責(zé)任公司）；EL204型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。漢桃葉采自廣西南寧市郊,并經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院劉步鳴教授鑒定為正品；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)為0770-200804）；二甲苯（北京長(zhǎng)?；S,批號(hào)為20080530）；醋酸（天津市泰興化工有限公司,批號(hào)為20091203）；延胡索乙素（中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)為110726-200409）；地塞米松（長(zhǎng)春長(zhǎng)紅制藥廠,批號(hào)為20100419）；伊文思藍(lán)（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)為20090913）；其他試劑均為分析純。昆明種小鼠,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,SPF級(jí),證書(shū)號(hào)為SCXK桂2009-0002。

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測(cè)定

方法選擇:采用分光光度法,以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定漢桃葉醇提物總黃酮含量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:參照文獻(xiàn)[3],采用分光光度法,以蘆丁為對(duì)照品測(cè)定并繪制質(zhì)量濃度（C）對(duì)吸光度（A）的標(biāo)準(zhǔn)曲線,測(cè)定值經(jīng)最小二乘法進(jìn)行線性回歸,分析得蘆丁對(duì)照品的回歸方程為A= 1.0527C ＋ 0.0059（r= 0.9999）。

樣品測(cè)定:稱取漢桃葉粗粉適量,按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的最佳工藝條件進(jìn)行提取,過(guò)濾后濾液轉(zhuǎn)至100mL容量瓶,加乙醇定容至100 mL,即得待測(cè)樣品溶液。精確吸取該溶液2mL,稀釋至10mL,再吸取5 mL置試管中,參照文獻(xiàn)[3]的方法,以空白試劑作對(duì)照,于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算樣品中總黃酮含量。

2.2 黃酮提取工藝優(yōu)化(正交試驗(yàn))

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)得知,影響漢桃葉黃酮類物質(zhì)含量提取效果的主要因素有乙醇濃度（因素A）、提取時(shí)間（因素B）、提取次數(shù)（因素C）和固液比（D）,故以漢桃葉總黃酮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),按照 L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì),因素水平見(jiàn)表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

按照表1中的因素水平進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2和表3?？梢?jiàn),影響黃酮得率的因素主次為乙醇濃度 ＞提取時(shí)間 ＞固液比 ＞提取次數(shù),以極差最小的C因素作為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析,表明A因素有顯著性差異,故提取的最佳條件為 A2B3C2D2。在此條件下,經(jīng)平行檢驗(yàn)5次,得黃酮平均提取率為20.09mg/g,進(jìn)一步驗(yàn)證了正交試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表2 黃硐提取工藝 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差結(jié)果分析表

2.3 活性測(cè)試試驗(yàn)[4-5]

藥液制備:用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)得出的最佳工藝對(duì)漢桃葉藥材進(jìn)行提取,得總黃酮浸膏加適量蒸餾水制成濃度為0.2 g/mL的藥液,備用。

鎮(zhèn)痛試驗(yàn):取小鼠50只,雌雄各半,稱重標(biāo)記后隨機(jī)分為生理鹽水組（NS,A組）、延胡索乙素組(B組)和漢桃葉高、中、低劑量組(C1,C2,C3組),每組 10 只,灌胃給藥,每日 1 次,連續(xù)給藥 7 d。末次給藥30min后,向各鼠腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2mL（用前配制）。觀察并記錄注射醋酸溶液后20 min內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)次數(shù)及時(shí)間以評(píng)價(jià)藥物的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果見(jiàn)表4,B組和C1組與A組比較有顯著性差異（P＜0.01）,C1組鎮(zhèn)痛效果與B組相當(dāng)。

表4 漢桃葉黃酮鎮(zhèn)痛試驗(yàn)結(jié)果（±s,n=10）

表4 漢桃葉黃酮鎮(zhèn)痛試驗(yàn)結(jié)果（±s,n=10）

P 抑制率（%）組別A組B組C 1組C 2組C 3組給藥量20 mL/k g 50 m g/k g 50 g/k g 30 g/k g 10 g/k g扭體次數(shù)27.5±2.36.9±2.77.6±2.79.2±2.112.8±2.174.9172.3666.5453.45＜0.01＜0.01＜0.05

二甲苯致小鼠耳腫脹試驗(yàn):取昆明種小鼠50只,雌雄各半,隨機(jī)分為空白對(duì)照組(A組),地塞米松組(B組),漢桃葉高、中、低劑量組(C1,C2,C3組),每組 10只。每只小鼠灌胃給藥每日 1次,連續(xù)給藥7 d,于末次給藥時(shí),分別將每只小鼠左耳外側(cè)均勻涂抹二甲苯0.05mL,右耳不涂二甲苯,4 h后脫頸處死,用直徑8mm的打孔器在同一部位取下耳片,稱取質(zhì)量,用左右耳片質(zhì)量差值來(lái)表示腫脹程度。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。與A組相比,C1組小鼠耳廓腫脹程度顯著降低（P＜0.05）,C3組也有一定的降低；在較高劑量時(shí),漢桃葉黃酮與地塞米松抗炎作用相當(dāng)。

表5 漢桃葉黃酮對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)結(jié)果(±s,n=10)

表5 漢桃葉黃酮對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹試驗(yàn)結(jié)果(±s,n=10)

組別A組B組C 1組C 2組C 3組給藥量抑制率（%）P 20 m g/k g 50 g/k g 30 g/k g 10 g/k g腫脹度（m g/g）19.16±1.337.56±3.178.29±1.1810.04±1.1312.12±2.1860.5456.7347.6036.74＜0.05＜0.05

3 討論

本研究結(jié)果顯示,漢桃葉黃酮類物質(zhì)最佳提取工藝為藥材粗粉加8倍量80%乙醇回流提取2次,每次1.5 h。本研究中所制備的黃酮在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、抗炎作用,提示漢桃葉黃酮類物質(zhì)可能為該藥材鎮(zhèn)痛、抗炎的活性物質(zhì)。本研究結(jié)果對(duì)于漢桃葉藥材在抗風(fēng)濕、類風(fēng)濕的新藥研發(fā)其有重要的參考意義。

參考文獻(xiàn):

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