改良Von Clauss法檢測冷沉淀凝血因子中纖維蛋白原

【摘要】目的：規(guī)范血站冷沉淀凝血因子中纖維蛋白原的檢測方法，簡化操作步驟，提高準(zhǔn)確性。方法：根據(jù)Von Clauss法的原理，結(jié)合冷沉淀凝血因子中纖維蛋白原的濃度較高特點，將待測或參比血漿稀釋比例由原來的10倍稀釋調(diào)整為20倍稀釋。結(jié)果：纖維蛋白原的濃度對數(shù)與凝固時間的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=-0.999，線性達(dá)到1.24～9.92g/L。結(jié)論：血站使用的半自動或全自動血凝儀，內(nèi)置的纖維蛋白原檢測方法為經(jīng)典的Von Clauss法，但冷沉淀凝血因子中纖維蛋白原的濃度已超出其線性范圍，檢測前需手工稀釋，將Von Clauss法進(jìn)行改良后，樣本無需稀釋，其線性范圍完全滿足需求，既減少了試驗步驟，又減少了因手工稀釋帶來的誤差，提高了準(zhǔn)確性。

【關(guān)鍵詞】改良Von Clauss法 冷沉淀凝血因子 纖維蛋白原

隨著輸血醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，冷沉淀凝血因子的臨床應(yīng)用倍受國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的重視[1]。冷沉淀凝血因子中含Ⅷ因子、纖維蛋白原、纖維結(jié)合蛋白、血管性血友病因子等，目前廣泛應(yīng)用于甲型血友病、血管性假性血友病、纖維蛋白缺乏癥、DIC、燒傷以及其他出血性疾病的治療。冷沉淀凝血因子中Ⅷ因子和纖維蛋白原含量是直接影響治療效果的重要因素，以2個單位的冷沉淀凝血因子為例，GB 18469-2012《全血及成分血質(zhì)量要求》中要求纖維蛋白原含量≥150mg，Ⅷ因子含量≥80IU[2]。血站質(zhì)控科每月都會對按照制備量的1%或至少4袋進(jìn)行抽樣檢測[3]，離心法制備的冷沉淀凝血因子容量為20～30ml，纖維蛋白原濃度一般至少在5g/L以上。傳統(tǒng)的檢測方法為將樣本進(jìn)行稀釋后檢測，為了更好地對冷沉淀凝血因子中的纖維蛋白原進(jìn)行質(zhì)量控制，保證準(zhǔn)確性，現(xiàn)對Von Clauss試驗方法進(jìn)行改良，報道如下：

1材料與方法

1.1材料

希森美康生物科技（無錫）有限公司提供的纖維蛋白原測定試劑、TC緩沖液，希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司提供的CA CLEAN I、標(biāo)準(zhǔn)血漿。

1.2儀器

全自動血凝儀（制造商：希森美康，型號：CA-510）

1.3方法

1.3.1準(zhǔn)備試劑：按試劑說明書要求復(fù)溶纖維蛋白原測定試劑和標(biāo)準(zhǔn)血漿。

1.3.2方法設(shè)置：在儀器主界面依次按“Setting”“Analysis Setting”“Test Protocol”“Fbg”，此時“End Point”設(shè)置為50%，“Sensitivity.”設(shè)置為High Gain，“SampleVol”設(shè)置為5μl，“Dil.Vol.”設(shè)置為95μl，“Reagent 1”設(shè)置為180sec，“Reag.Vol.”設(shè)置為50μl，“Post.Rinse”設(shè)置為“1”，其他設(shè)置不變，按“Fix”保存。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)定：將各試劑按位置放好，復(fù)溶好的標(biāo)準(zhǔn)血漿放到“1號”標(biāo)本位。在儀器主界面依次按“Standard Curve”“Select Test”“Fbg”“Standard Analysis”，連續(xù)按“Select Dil.Set”選擇第11種稀釋模式，“Replic.”調(diào)成2次，在“Fbg”處按標(biāo)準(zhǔn)血漿說明書鍵入靶值濃度，按“Start”開始定標(biāo)。

2結(jié)果

相關(guān)系數(shù)r=-0.999，線性范圍1.24～9.92g/L，表明纖維蛋白原濃度對數(shù)與凝固時間的對數(shù)呈很好的線性關(guān)系，且線性范圍適合測定冷沉淀凝血因子中的纖維蛋白原。

3討論

幾乎所有的血凝儀都是針對臨床實驗室設(shè)計的，Von Clauss法為經(jīng)典的測定纖維蛋白原方法，依據(jù)健康人群血漿中纖維蛋白原含量設(shè)計的稀釋比例，即10倍稀釋，10μl樣本與90μlTC緩沖液混合后37℃預(yù)熱3分鐘，再加入50μl的凝血酶（纖維蛋白原測定試劑），然后儀器判定凝固時間，一般都取50%凝固點時間為凝固時間，因為“S型”凝固曲線此時最為敏感，纖維蛋白原的濃度對數(shù)和凝固時間的對數(shù)呈線性關(guān)系。筆者根據(jù)血站的實際工作需要，對上述方法進(jìn)行改良，改為20倍稀釋，即5μl樣本與95μl TC緩沖液混合，其他步驟沒變，該型號的血凝儀加樣靈敏度為1μl，完全滿足準(zhǔn)確度需求，減少了手工預(yù)稀釋帶來的誤差，提高了準(zhǔn)確性。血凝儀在定標(biāo)時大多提供多個稀釋模式，筆者也嘗試了在未改變稀釋倍數(shù)的前提下，在定標(biāo)時，選擇較小稀釋倍數(shù)的模式，即線性范圍適合較高纖維蛋白原濃度的曲線，結(jié)果纖維蛋白原的濃度對數(shù)和凝固時間的對數(shù)的線性關(guān)系很差，r值不理想。其原因為在測定濃度較高的點時，凝固時間很短，只有幾秒，因此兩對數(shù)之間線性很差。更改了方法學(xué)里的稀釋倍數(shù)后，重新定標(biāo)解決了這一問題，對Ⅷ因子的檢測也用類似的思路加以改進(jìn)，成分血液和正常血漿中的一部分檢測項目的濃度有很大差別，而大多數(shù)的儀器設(shè)備、試劑都是針對臨床的，相對于血站來說，只有我們不斷的改進(jìn)方法，才能找到適合成分血液檢測的新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]畢紹華，李永志，等.冷沉淀制劑治療Ⅱ度燒傷的臨床觀察[J].中國輸血雜志，2007，20（3）：31.

[2]GB 18469-2012，全血及成分血質(zhì)量要求[S].

[3]衛(wèi)醫(yī)政發(fā)〔2012〕1號附件，血站技術(shù)操作規(guī)程[S].