鴿源新城疫病毒的分離與鑒定

董孝乾 孔艷 高月花 王震 劉妮妮 史效茹 李園

摘 要：山西地區(qū)某商品信鴿養(yǎng)殖場(chǎng)的信鴿死亡淘汰率突然增加，這些病鴿主要表現(xiàn)為食欲下降、排白綠色稀糞，頭頸斜仰扭轉(zhuǎn)于頸后、呈現(xiàn)觀星狀，表現(xiàn)出一種典型神經(jīng)癥狀。主要剖檢癥狀為內(nèi)臟器官不同程度的腫脹與出血，結(jié)合流行病學(xué)、臨床癥狀、病例剖解變化，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離、病毒分離以及RT-PCR檢測(cè)，最終被確診為鴿新城疫。

關(guān)鍵詞：鴿；新城疫；細(xì)菌分離；病毒分離；RT-PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.39 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1673-1085（2014）11-0011-04

鴿新城疫是由副粘病毒科副粘病毒屬禽I型副粘病毒[1]感染引起的一種高度接觸性、急性敗血性傳染病[2]。該病發(fā)病急，傳播迅速，死亡率高，是養(yǎng)鴿業(yè)的最大危害之一[3]。臨床主要表現(xiàn)為體溫升高、食欲下降，羽毛失去光澤；排白綠色稀糞；發(fā)病2～3d后出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀，頭頸震顫，一側(cè)或者兩側(cè)翅或腿麻痹，共濟(jì)失調(diào)，頭頸歪斜或頭扭轉(zhuǎn)置于背上呈特殊的觀星狀[4]，最終麻痹死亡。2013年8月山西某養(yǎng)殖場(chǎng)的信鴿出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)與呼吸系統(tǒng)混合感染癥狀的疾病，根據(jù)其臨床癥狀疑為鴿新城疫。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室病原分離及RT-PCR方法檢測(cè)證實(shí)為鴿新城疫，現(xiàn)將分離鑒定流程及結(jié)果作如下報(bào)告：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來(lái)源 病鴿來(lái)源于山西地區(qū)某信鴿養(yǎng)殖場(chǎng)，病鴿為28～50日齡。養(yǎng)殖戶采取家養(yǎng)方式飼養(yǎng)。

1.1.2 試驗(yàn)用雞胚 10日齡SPF雞胚，由山東無(wú)特定病原雞實(shí)驗(yàn)種雞場(chǎng)提供。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 10日齡SPF雛雞，由山東無(wú)特定病原雞實(shí)驗(yàn)種雞場(chǎng)提供種蛋，公司SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房孵化出雛，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房負(fù)壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)至所需日齡。

1.1.4 1%雞紅細(xì)胞 取SPF公雞血5ml，加入抗凝劑，生理鹽水沖洗、1500rpm/min離心7min，反復(fù)操作3次，制備雞紅細(xì)胞懸液。

1.1.5 培養(yǎng)基及生化試劑 NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株F48E9及NDV陽(yáng)性血清，均由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所禽病研究室保存。

禽流感（AIV H9）標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，來(lái)自于農(nóng)業(yè)部動(dòng)物衛(wèi)生檢疫所。

AIV雞減蛋綜合征（EDS）標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，購(gòu)自于中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏中心。

Taq酶、PCR Marker以及M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒等，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

細(xì)菌培養(yǎng)基及其他生化試劑均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病鴿解剖觀察 采用常規(guī)解剖方法對(duì)病鴿進(jìn)行解剖，觀察病鴿的組織器官病理變化，并無(wú)菌采集病料。

1.2.2 病料處理 對(duì)無(wú)菌采集病鴿腸道、氣管、肝臟、腎臟以及腦組織進(jìn)行如下處理：其中腸道、氣管、肝臟、腎臟混合加入含有2000IU/ml[5]雙抗的生理鹽水進(jìn)行研磨，腦組織單獨(dú)進(jìn)行研磨，獲取研磨液。將研磨液反復(fù)凍融三次，8000rpm/min離心15min，過(guò)濾除菌，獲取上清液。

1.2.3 無(wú)菌檢測(cè) 取反復(fù)凍融后的上清液進(jìn)行細(xì)菌分離，無(wú)菌接種血清平板，37℃培養(yǎng)，24～48h[4]觀察是否有細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.2.4 病毒分離 取反復(fù)凍融后的上清液接種11日齡雞胚，每枚雞胚接種0.1ml，37℃孵化120h，24h內(nèi)死胚棄去，收集24～120h死亡雞胚尿囊液，測(cè)定尿囊液是否有血凝性，并觀察雞胚病理變化。將尿囊液進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)M(jìn)行盲傳，測(cè)定其血凝效價(jià)，盲傳至血凝價(jià)不再發(fā)生變化，按照Reed和Muench法計(jì)算ELD50[6]，并且計(jì)算10日齡雞胚的平均死亡時(shí)間MDT[2]，即MDT=（Ah死亡雞胚數(shù)×Ah+Bh死亡雞胚數(shù)×Bh+……）/死亡雞胚總數(shù)。

1.2.5 病毒鑒定

1.2.5.1 HA與HI試驗(yàn) 將無(wú)菌收獲的尿囊液進(jìn)行血凝（HA）試驗(yàn)，如果出現(xiàn)血凝，用雞NDV、EDS、AIV H9標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行血凝（HI）抑制試驗(yàn)，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5.2 RT-PCR 參照已發(fā)表鴿NDV序列，設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物：正鏈引物為：5' -AGTGTAGCTCTTGGGGTTG-3'，負(fù)鏈引物為5'-ACTGCTGCATCTTCCCAAC-3'，擴(kuò)增片段大小為184bp。另針對(duì)鴿NDV F基因，設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于擴(kuò)增F基因全序列：正鏈引物為5'-ATGGGCTCCAAACCTTCTAC-3'，負(fù)鏈引物為5'-TTGTAGTGGCTCTCATC-3'。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。雞胚尿囊液及病料組織RNA提取按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。取DEPC水溶解后的RNA模板，加正鏈引物1μl，于70℃作用5min后，分別加入5×reaction buffer 4μl，Ribonuclease inhibitor 1μl，10mmol/L dNTP 2μl，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶1μl，冰浴混勻，37℃ 60min，70min作用10min，反轉(zhuǎn)錄完成；取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系如下：RT產(chǎn)物5μl，正負(fù)鏈引物各1μl，10×PCR緩沖液2.5μl，10mmol/L dNTPs 1.25μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，加ddH2O至總體積25μl，反應(yīng)條件如下：94℃ 3min，然后94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 60s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，取5μl反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝電泳鑒定?；厥誇基因擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行克隆測(cè)序，利用MEGA軟件進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 臨床癥狀 病鴿表現(xiàn)為精神萎頓，食欲下降，厭食，并出現(xiàn)明顯的神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為頭頸斜仰扭轉(zhuǎn)于頸后、頭向后側(cè)仰呈觀星癥狀；眼睛病變主要表現(xiàn)為凹陷、部分病鴿眼睛出現(xiàn)炎癥，具有膿性分泌物；病鴿出現(xiàn)明顯的綠色糞便，肛門(mén)周?chē)痪G色糞便污染。

2.2 病理剖檢病變 氣管內(nèi)有粘性分泌物，氣管環(huán)出血；喉頭、腸道以及腦組織有不同程度的出血；腎臟腫脹明顯，并出血；消化道、呼吸道有較多粘液回流，肌胃充滿綠色內(nèi)容物；腦組織水腫、充血，并伴有少量出血點(diǎn)；肝臟輕微腫大，邊緣出現(xiàn)不同程度壞死；氣囊渾濁，周?chē)邪咨衫椅锔街?/p>

2.3 無(wú)菌檢測(cè) 24～48h，觀察已接種血清平板，均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.4 病毒分離 死亡雞胚尿囊液，初代最高血凝價(jià)為1：22，盲傳五代之后血凝價(jià)達(dá)到1：28。生物學(xué)特性測(cè)定，對(duì)鴿子病料進(jìn)行105、106、107倍稀釋?zhuān)瑴y(cè)得 ELD50=106.5；第一代MDT=72.35h，第二代MDT=86.32h，第三代MDT=83h，第四代MDT=77h，第五代MDT=66.7h，第六代MDT=55.7h。

2.4.1 初代雞胚病變 48h死亡雞胚瘦小，胚體充血嚴(yán)重，并伴有不同程度出血，尤以頸部出血嚴(yán)重；92、102h死亡雞胚全身水腫，出血嚴(yán)重，肝臟表現(xiàn)為嚴(yán)重的花斑樣，肌胃出血嚴(yán)重，尿囊液渾濁且粘稠。

2.4.2 盲傳雞胚病變 死亡雞胚尿囊液粘稠，全身水腫，出血嚴(yán)重，腎臟腫大出血，全部胚體肝臟出現(xiàn)明顯的花斑樣，腹腔內(nèi)充滿乳白色液體，肌胃與脾臟出血嚴(yán)重；盲傳第4代雞胚尿囊液清亮，其余病變與前幾代相比沒(méi)有明顯變化；盲傳第6代胚體整體表現(xiàn)瘦小，出血與水腫現(xiàn)象有一定程度的減輕，花斑肝現(xiàn)象明顯減輕，只有個(gè)別胚體出現(xiàn)，其他病變無(wú)明顯變化。

2.5 病毒鑒定

2.5.1 HA與HI試驗(yàn) 雞胚尿囊液出現(xiàn)明顯的血凝現(xiàn)象，這種血凝現(xiàn)象能夠被NDV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清抑制，而不被EDS、AIV H9標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清所抑制，這說(shuō)明分離到的病原為新城疫病毒，并將該毒株命名為APMV-1/Pigeon/China/SX13/2013（簡(jiǎn)稱(chēng)SX13）。

2.5.2 RT-PCR 病料上清和雞胚尿囊液PCR產(chǎn)物電泳后均出現(xiàn)184bp條帶，說(shuō)明新城疫核酸檢測(cè)均為陽(yáng)性，見(jiàn)圖1。該毒株F基因ORF全長(zhǎng)為1662bp，裂解位點(diǎn)氨基酸序列為112RRQKRF117，在114位Q的兩側(cè)為2對(duì)堿性氨基酸，第117位為F，符合強(qiáng)毒裂解位點(diǎn)序列特征[7]。利用MEGA軟件對(duì)其進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析表明，該病毒屬基因VI型，見(jiàn)圖2。

3 分析討論

3.1 病鴿臨床癥狀和病理剖檢病變均與雞新城疫癥狀有很多相似之處，尤以神經(jīng)系統(tǒng)與呼吸消化系統(tǒng)變化最為相似，根據(jù)以上癥狀初步診斷為新城疫病毒感染。通過(guò)對(duì)病鴿的實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌分離、病毒分離以及RT-PCR檢測(cè)，最終確診為鴿新城疫。

3.2 本次實(shí)驗(yàn)，用最初的病料作盲傳，血凝價(jià)并不高，盲傳到第三代血凝價(jià)僅為1：24；第六代時(shí)，血凝價(jià)較高，達(dá)到1：28，血凝價(jià)趨于穩(wěn)定，這提示我們?cè)趶氖虏≡姆蛛x與鑒定時(shí)，第一代沒(méi)有出現(xiàn)血凝價(jià)時(shí)，要多盲傳幾代，以免因分離不徹底而影響結(jié)果判斷，造成不必要的損失[8]。通過(guò)MDT數(shù)值可知，MDT的數(shù)值從第二代至第六代逐漸變小，這說(shuō)明該病原在一定盲傳代數(shù)內(nèi)，每盲傳一代，10日齡雞胚的平均死亡時(shí)間呈現(xiàn)總體縮短的趨勢(shì)，病毒致病力有所增強(qiáng)；從MDT數(shù)值上分析，結(jié)合ELD50=106.5確定該致病原為新城疫中強(qiáng)毒株。

3.3 新城疫是商品鴿所有疫病中發(fā)生頻率最高、危害最大的一類(lèi)傳染病，約占臨床病例的20%～30%。該病在上世紀(jì)80年代初開(kāi)始在我國(guó)流行，并逐年增多，現(xiàn)已廣泛流行于我國(guó)各地區(qū)。該病的發(fā)生沒(méi)有明顯的季節(jié)性，不同品種、日齡的鴿均可感染此病，但幼鴿更易感。該病的傳播途徑是消化道和呼吸道，是一種接觸性傳播疾病，自然感染的鴿群發(fā)病率和死亡率變化較大，一般在20%～90%，幼鴿可達(dá)100%[5]。

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需經(jīng)病毒分離后，再通過(guò)血清學(xué)試驗(yàn)判斷是否為NDV感染，耗時(shí)耗力。本文中同時(shí)采用了病毒分離、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)以及RT-PCR兩種方法進(jìn)行診斷，前者需經(jīng)至少60h才能得出結(jié)果，而RT-PCR方法在8h之內(nèi)即可判斷核酸檢測(cè)是否為陽(yáng)性，就可以確定是否為新城疫感染，這大大節(jié)約了診斷時(shí)間，更加有利于該病的診斷與防控。

從病毒基因型上講，鴿源NDV絕大多數(shù)為基因Ⅵ型，而雞源強(qiáng)毒NDV一般為Ⅶ型，二者致病性有所不同，抗原性之間也有一定差異，但目前市場(chǎng)上仍無(wú)鴿專(zhuān)用的新城疫疫苗，一旦發(fā)生該病，可用雞新城疫La Sota、Clone30等弱毒疫苗緊急接種。通常情況下，建議一周日齡左右雛鴿進(jìn)行一次新城疫弱毒疫苗免疫，青年鴿在1月齡左右進(jìn)行一次滅活疫苗免疫，種鴿留種前根據(jù)抗體水平適當(dāng)進(jìn)行1～2次滅活疫苗免疫，基本可以對(duì)本病起到較好的防控作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫蘭英，杜守信，于國(guó)杰.肉鴿新城疫的診治報(bào)告[J].農(nóng)技服務(wù)，2009，26（9）：68-69.

[2] 劉振湘.湖南省鴿新城疫病毒的分離與鑒定[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2002，19（10）：22-24.

[3] 符子華，張波，易忠.等.鴿新城疫病原的分離與鑒定[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，41（專(zhuān)刊）：32-34.

[4] 陳軼霞，韓慶彥，楊小玲.鴿新城疫的病原分離與鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)科技，2001，31（2）：31-32.

[5] 李霞，亓麗紅，于可響.等.肉鴿新城疫強(qiáng)毒的分離與鑒定[J].家禽科學(xué)，2008（9）：37-38.

[6] 俞伏松.胡奇林，陳少鶯.等.1株雞新城疫強(qiáng)毒株的分離與鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2001-37（8）：24-25.

[7] 劉華雷，王永坤，嚴(yán)維巍，等.中國(guó)部分地區(qū)新城疫病毒的分子流行病學(xué)研究[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）.2001，1（4）：35-40.

[8] 熊永忠，王秀榮，曹殿軍，等.鴿源新城疫病毒的分離與鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2002，5：22.