板藍(lán)根多糖的制備及其對雞新城疫Lasota疫苗的免疫效果研究

陳光明等

摘要

[目的] 研究自制的板藍(lán)根多糖對雞新城疫弱毒疫苗的免疫效果。[方法] 將120只健康A(chǔ)A 肉仔雞隨機(jī)分為板藍(lán)根多糖組、黃芪多糖組以及生理鹽水對照組，研究板藍(lán)根多糖對雞新城疫Lasota疫苗的免疫增強(qiáng)作用。[結(jié)果]板藍(lán)根多糖組和黃芪多糖組雞NDV血凝抑制抗體滴度差異不顯著，而板藍(lán)根多糖組和黃芪多糖組雞的免疫器官指數(shù)都顯著高于生理鹽水對照組。[結(jié)論] 制備的板藍(lán)根多糖可以用作雞新城疫弱毒疫苗的免疫增強(qiáng)劑。

關(guān)鍵詞板藍(lán)根；多糖；新城疫；Lasota疫苗；免疫效果

中圖分類號S853.7文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2014）36-12920-02

Abstract[Objective] The research aimed to study the immune effects of selfprepared polysaccharide of Isatis root on the attenuated vaccine of chicken newcastle disease. [Method] 120 healthy AA broiler chicken were randomly divided into Isatis root polysaccharide group，Astragalus polysaccharide group and normal saline control group. The immuneenhancing effects of Isatis root polysaccharide on Lasota vaccine of chicken newcastle disease were studied. [Result] HI antibody titer of chicken NDV had no significant difference between Isatis root polysaccharide and Astragalus polysaccharide group. The immune organ index of broilers in Isatis root polysaccharide and Astragalus polysaccharide group was significantly higher than that of normal saline control group. [Conclusion] The prepared polysaccharide of Isatis root could be used as the immune enhancer of attenuated vaccine of chicken newcastle disease.

Key wordsIsatis root； Polysaccharide； Newcastle disease； Lasota vaccine； Immune effects

新城疫是由副黏病毒引起的雞、火雞、鴿等禽類的一種烈性傳染病，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。雖然新城疫疫苗的應(yīng)用有效地減少新城疫對養(yǎng)禽業(yè)的危害，但近年來由于病毒的變異以及疫苗或者抗生素的濫用常常導(dǎo)致養(yǎng)雞場雞新城疫的免疫失敗。最新研究表明，免疫增強(qiáng)劑的應(yīng)用可以有效減少免疫失敗的發(fā)生。研究表明，許多種中藥多糖都具有明顯的免疫增強(qiáng)作用?；诖耍P者制備了板藍(lán)根多糖，研究其對雞新城疫弱毒疫苗免疫的效果。

1材料與方法

1.1材料與儀器

黃芪多糖，購于山西兆益生物有限公司；板藍(lán)根多糖，自制；新城疫Lasota株弱毒疫苗，購自南京天邦生物科技有限公司；雞新城疫HI測試抗原（由動物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供）；離心機(jī)；微量移液器。

1.2試驗(yàn)動物

1日齡非免疫健康A(chǔ)A肉雞120只，由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物房代購。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1藥物提取與試劑制備。

1.3.1.1阿氏液配制。稱取葡萄糖2.05 g、氯化鈉0.42 g、檸檬酸鈉0.80 g，放入裝有850 ml三蒸水的燒杯中，用0.1%檸檬酸溶液，緩慢滴加，調(diào)節(jié)pH至7.2，用1 000 ml容量瓶定容至1 000 ml后用無菌濾膜過濾除菌，置于 4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2雞紅細(xì)胞懸液的制備。采集雞外周血5 ml，轉(zhuǎn)移到20 ml阿氏液中，4 ℃下保存。使用前，先用生理鹽水洗滌，然后2 000 r/min離心5 min，共洗滌3次后，用生理鹽水配制成紅細(xì)胞懸液濃度為1%。

1.3.1.3板藍(lán)根多糖的制備。板藍(lán)根飲片購自泰州芝林大藥房。取板藍(lán)根飲片200 g，加入2 000 ml三蒸水微沸煎煮2 h，過濾，濾渣加入2 000 ml三蒸水微沸煎煮1.5 h，趁熱過濾。合并2次所得濾液濃縮至200 ml加入無水乙醇800 ml，調(diào)整醇濃度80%。靜置過夜，棄去上清將所得沉淀溶于100 ml蒸餾水中，加入400 ml無水乙醇調(diào)整最終含醇量為80%，靜置過夜，棄上清，將沉淀在60 ℃恒溫干燥箱中烘干，稱重。使用前，用三蒸水配制成10 mg/ml，高壓滅菌，4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2動物分組及處理。

健康A(chǔ)A 肉仔雞120只，隨機(jī)分為3組：板藍(lán)根多糖組（Ⅱ）、黃芪多糖組（Ⅰ）以及生理鹽水對照組（Ⅲ），每組40只。4日齡分別用10 mg/ml黃芪多糖、10 mg/ml板藍(lán)根多糖、生理鹽水注射液，以0.5 ml/羽的劑量進(jìn)行肌肉注射，每天1次，連用3 d；7日齡用新城疫Ⅳ系弱毒苗點(diǎn)眼滴鼻免疫，21日齡用1羽份的新城疫Ⅳ弱毒苗二免，0.3 ml/羽（表1）。免疫后分別于7、14、21、28、35、42、49日齡隨機(jī)選取5只雞，通過翅靜脈采血，待血液凝固后，分離血清，然后通過血凝抑制試驗(yàn)檢測雞新城疫血凝抑制抗體效價。分別于14、21、28、35及42日齡隨機(jī)取6只雞，放血致死后稱重，分別摘取脾臟、胸腺、法氏囊并逐一稱重，計(jì)算每只雞的免疫器官指數(shù)。

表1試驗(yàn)分組與處理

組別7日齡21日齡

ⅠNDV弱毒疫苗+黃芪多糖NDV弱毒疫苗+黃芪多糖

ⅡNDV弱毒疫苗+板藍(lán)根多糖NDV弱毒疫苗+板藍(lán)根多糖

ⅢNDV弱毒疫苗+生理鹽水NDV弱毒疫苗+生理鹽水

1.3.3雞血清新城疫血凝抑制抗體效價檢測。

1.3.3.1NDV抗原效價的測定。

取96孔微量血凝板，第1排從左側(cè)開始的第1～12孔按照50 μl/孔的劑量加入PBS溶液，第2排和第3排重復(fù)操作。向每排第1孔加入50 μl的新城疫病毒診斷抗原，反復(fù)吹吸3次后，吸取50 μl加入第2孔，同樣操作依次向后進(jìn)行2倍稀釋，一直稀釋到第11孔，然后將第11孔吸取50 μl棄去，第12孔不添加病毒抗原液。然后，取1%雞紅細(xì)胞懸液，輕輕搖動混勻后，按照50 μl/孔的劑量向每孔加入紅細(xì)胞懸液，然后將微量板振動30 s，置于37 ℃溫箱中作用30 min，觀察結(jié)果。經(jīng)測定該診斷液的抗原凝集價為26，由此確定4單位抗原的稀釋度為24。

1.3.3.2血凝抑制試抗體效價的測定。

取96孔微量血凝板，從第1排從左到右的第1～11孔各加入50 μl 的磷酸鹽緩沖溶液，再向第1排的第1孔加入50 μl待檢血清，然后，依次向后進(jìn)行2倍的倍比稀釋，一直稀釋到第10孔，第11孔加入陽性血清，第12孔加入陰性血清。第2排和第3排作重復(fù)。倍比稀釋完成后向每孔加入配制好的4單位新城疫病毒抗原（將新城疫病毒診斷抗原進(jìn)行16倍稀釋）50 μl/孔，振蕩混勻30 s，放入37 ℃溫箱。 20 min后，取出向每孔加入1%雞紅細(xì)胞懸液50 μl/孔。振蕩混勻，然后置于37 ℃恒溫箱中作用30 min，觀察結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1新城疫血凝抑制抗體效價

從圖1可以看出，7日齡板藍(lán)根多糖組的新城疫HI抗體效價略高于生理鹽水對照組（P>0.05）、黃芪多糖組的HI抗體效價略高于生理鹽水對照組（P>0.05）。14日齡以后，板藍(lán)根多糖組、黃芪多糖組HI抗體效價顯著高于生理鹽水對照組（P<0.05），黃芪多糖組抗體效價較板藍(lán)根多糖組抗體效價稍高，但差異不顯著。這種差異顯著性在28、35、42日齡仍然持續(xù)（P<0.05），42日齡抗體效價達(dá)到最高峰，49日齡抗體效價開始下降。

3討論

抗體是介導(dǎo)體液免疫的重要成分?？贵w效價的高低直接反映著機(jī)體的體液免疫狀態(tài)[1]。該試驗(yàn)結(jié)果表明板藍(lán)根多糖能顯著提高雞的NDHI抗體滴度水平，而且在提高抗體效價方面與黃芪多糖的免疫增強(qiáng)效果差異不顯著。

臨床上給雞群接種新城疫疫苗后，許多因素都可以導(dǎo)致免疫失敗，其中最重要的因素是疫苗保護(hù)率低和某些免疫抑制因素所致[2]。篩選和開發(fā)免疫增強(qiáng)劑勢在必行，目前用于免疫增強(qiáng)劑包括：細(xì)胞因子（如白介素2）、中藥成分（如黃芪多糖多糖、香菇多糖等）可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答過程，提高免疫效果[3]，增強(qiáng)了動物機(jī)體的抗病能力[4]。研究表明，板

藍(lán)根多糖能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬活性，

誘導(dǎo)生成干擾素，是較好的免疫刺激劑[5]。該試驗(yàn)結(jié)果表明板藍(lán)根多糖能夠促進(jìn)免疫器官（如脾臟、法氏囊）的發(fā)育，從而促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的生長。作為新型的免疫增強(qiáng)劑，板藍(lán)根多糖在提高動物機(jī)體的免疫功能和預(yù)防畜禽疾病方面有重要作用，為減少畜禽產(chǎn)品中的化學(xué)藥物殘留，保障人民的食品安全方面發(fā)揮更為重要的作用。

參考文獻(xiàn)

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