7株根瘤菌菌株與熱研2號柱花草共生最適磷濃度研究

董榮書 張潔 黃艷霞等

摘 要 采用水培的方法，設(shè)3個(gè)磷水平，7個(gè)菌株，通過對株高、莖葉鮮重、莖葉干重、固氮酶活性、莖葉氮含量、莖葉磷含量的測定及綜合分析，確定使熱研2號柱花草接種不同根瘤菌菌株達(dá)到最佳促生性能的磷濃度。結(jié)果表明：7個(gè)菌株在中磷時(shí)鮮重和含氮量最大，低磷不利于鮮重和含氮量的增加；經(jīng)主因子綜合分析，菌株YM11-1、RJS9-2、PN13-3在高磷時(shí)對熱研2號柱花草有最好的固氮促生效果，菌株LZ3-2、BS1-1、PN13-3在中等磷條件下有最好的固氮促生效果，菌株FS3-1-1在高磷和中磷都有最好的固氮促生效果。

關(guān)鍵詞 熱研2號柱花草；根瘤菌；最佳促生效果

中圖分類號 S54 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

熱研2號柱花草[Stylosanthes guianensis（Aublet）Swartz cv. Reyan No.2]由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心選育自184柱花草（Stylosanthes guianensis CIAT184），在我國熱帶、亞熱帶地區(qū)有較強(qiáng)的適應(yīng)性[1]。熱研2號柱花草具有莖葉產(chǎn)量高，適口性好，營養(yǎng)豐富，刈割后再生能力強(qiáng)，接種根瘤菌后固氮能力強(qiáng)的特性，在我國南方廣泛用于飼草、綠肥及水保[2-7]。接種高效根瘤菌是柱花草栽培的重要手段[8]，能有效的提高柱花草的產(chǎn)量及含氮量。目前在我國篩選出適合于熱研2號柱花草的高效菌株有6個(gè)[9]，相對于不接種可增產(chǎn)達(dá)4.98倍、含氮量增加可達(dá)2.04倍[10]。豆科植物接種根瘤不僅與植株與菌株基因型的搭配有關(guān)，還受外界環(huán)境的影響[11-12]。磷在豆科作物的生長和結(jié)瘤固氮過程中發(fā)揮著重要作用[13-14]。缺磷對豆科作物根瘤形成和生長的影響大于其對植物體生長的影響[15-16]，對大豆、蠶豆等作物的研究結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)磷可以促進(jìn)結(jié)瘤和固氮，但過多也會抑制根瘤的固氮效果[17-18]。在柱花草方面尚無對柱花草-根瘤菌體系最適磷濃度的研究，本研究通過水培對接種不同根瘤菌的熱研2號柱花草進(jìn)行不同濃度的磷處理，確定使熱研2號柱花草接種不同根瘤菌菌株達(dá)到最佳促生性能的磷濃度，以期為柱花草高產(chǎn)栽培的科學(xué)用肥及根瘤菌的科學(xué)施用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

熱研2號柱花草由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所牧草中心提供；供試菌株[19]及來源見表1；磷源用KH2PO4（AR），不同磷處理間少的K用K2SO4（AR）補(bǔ)足。

1.2 方法

1.2.1 無菌種苗的準(zhǔn)備 柱花草種子剝?nèi)シN皮，在80 ℃的熱水中浸泡5 min；分別于95%的乙醇（V/V，下同）和2 g/L的HgCl2溶液中浸泡5 min和3 min（滅菌）；取出，用無菌水沖洗5～6次；種子撒播在已滅菌鋪有發(fā)芽紙的培養(yǎng)皿中，發(fā)芽紙上澆無菌的50 μmol/L硫酸鈣溶液；于黑暗中發(fā)芽。待芽長至1 cm左右時(shí)移到1.5 mL的切除底部的小離心管中培養(yǎng)，離心管事先分裝好MS培養(yǎng)基，離心管固定在0.2 cm厚的定植板上，最后將定植板放在裝有1/2 Hoaglang營養(yǎng)液[8]的面包箱中育苗2周。

1.2.2 根瘤菌菌液的準(zhǔn)備 以YMA（Yeast Mannitol Agar）培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制固體、液體培養(yǎng)基放置2 d確認(rèn)無污染后將保存的各菌株活化于固體培養(yǎng)基上；培養(yǎng)5 d后將菌落接種于液體培養(yǎng)基中，在180 r/h、28 ℃搖床上培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600>0.9）。

1.2.3 水培系統(tǒng)的準(zhǔn)備、移苗及處理 水培試驗(yàn)用2 L小桶，小桶先用1 g/L高錳酸鉀浸泡2 min然后用去離子水沖洗晾干，小桶外圍用黑色袋套住遮光。定植板用厚1 cm泡沫板，每塊泡沫板上四邊均勻鉆4個(gè)小洞。水培通氣裝置有通氣泵、通氣管、通氣石、通氣接口、定時(shí)器。

育苗2周后，將離心管帶苗移到小桶定植板上，用海綿固定。移苗后第一周用1/4 Hoaglang營養(yǎng)液穩(wěn)定苗生長；移苗第二周用氮濃度100 mol/L的低氮營養(yǎng)液，同時(shí)接菌。將備用的菌液淋在根上，每株柱花草接5 mL菌液，并暫停通氣；3 d后再通氣。2周后每4 h通氣15 min。每周更換一次營養(yǎng)液；每2 d調(diào)一次營養(yǎng)液pH值至5.8。

1.2.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用雙因子隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)。菌株因子設(shè)8個(gè)水平（即設(shè)8個(gè)處理，包括接種R1～R7根瘤菌和不接種對照R8）；磷濃度因子設(shè)PL（低磷）、PM（中磷）、PH（高磷）3個(gè)水平，磷濃度CP：分別為5、150、200 μmol/L；4次重復(fù)。營養(yǎng)液pH值為5.8。

1.2.5 取樣及各指標(biāo)的測定 3個(gè)月后進(jìn)行收獲。剪下莖葉稱鮮重后放入信封于烘箱105 ℃殺青20 min，75 ℃烘干后稱重。地上部干樣用于氮的測定。將樣品粉碎，先用H2SO4-H2O2進(jìn)行消煮，用自動定氮儀（Kjedahl 2300）測定全氮。

用乙烯還原法通過氣相色譜測定根瘤固氮酶活性[8]。固氮酶活性以每小時(shí)每克鮮瘤將乙炔轉(zhuǎn)化為乙烯的能力表示[μmol/（h·g）]。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗(yàn)中所有的數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2000、JMP9等統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析，以Tukey HSD作為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)，顯著水平p<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱研2號柱花草接種不同根瘤菌鮮重和含氮量最佳磷濃度的確定

熱研2號柱花草接種不同根瘤菌莖葉鮮重在不同磷處理間差異顯著，不同菌株間變化情況也有差異。熱研2號柱花草接種7株菌株后莖葉鮮重在不同磷處理下的變化情況可分為3類：接種菌株R1、R2、R3后中磷的莖葉鮮重顯著高于高磷和低磷，高磷和低磷間差異不顯著；接種菌株R4后，中磷>高磷>低磷，三者差異顯著；接種菌株R5、R6、R7后，高磷和中磷間差異不顯著，低磷顯著低于二者。

熱研2號柱花草接種7個(gè)根瘤菌菌株在不同磷處理下莖葉含氮量除接種菌株R1差異不顯著外，其他6個(gè)菌株都呈現(xiàn)中磷顯著高于低磷且高磷與低磷差異不顯著的規(guī)律。

2.2 熱研2號柱花草接種根瘤菌的最適磷濃度的確定

通過對不同磷處理下熱研2號柱花草接種不同根瘤菌的株高、莖葉干重、固氮酶活性、莖葉氮含量、莖葉磷含量等指標(biāo)進(jìn)行因子分析，前2個(gè)因子的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到79.58%（一般情況下，累積貢獻(xiàn)率超過75%即可），因此可提煉2個(gè)公因子。通過最大方差旋轉(zhuǎn)法得到旋轉(zhuǎn)因子載荷矩陣。在第一公因子（F1）中，株高、固氮酶活性、莖葉干重、莖葉含氮量等5個(gè)指標(biāo)上具有大的載荷（一般情況下，將載荷絕對值大于0.4的視為高載荷），F(xiàn)1是除植株含磷量外的性狀的綜合體現(xiàn)，代表了熱研2號柱花草接種根瘤菌后在不同磷水平下的生物量和固氮能力，F(xiàn)1的方差貢獻(xiàn)率為58.63%；在F2中，植株含磷量具有較高的正載荷，F(xiàn)2可稱為植株含磷因子，該因子的方差貢獻(xiàn)率為20.95%。

根據(jù)各個(gè)觀測值在第一和第二主因子上的標(biāo)準(zhǔn)得分，繪制關(guān)于生物量和固氮能力（X軸）和植株含磷量（Y軸）的二維平面圖。R1H、R2M、R3H、R3M、R4H、R5M、R6M、R7H位于圖中的第1象限在生物量、固氮能力及植株含磷量上都是正值，熱研2號柱花草菌株接種菌株R1、R7的最適磷濃度為高磷，接種菌株R2、R4、R5、R6的最適磷濃度為中磷，接種菌株R3在中磷和高磷都能達(dá)到較好的固氮促生效果；R1L、R2L、R3L、R4L、R5L、R6L、R7L位于圖中的第3象限，在生物量、固氮能力及植株含磷量上都是負(fù)值，低磷條件不利于各菌株與熱研2號柱花草的共生固氮作用。

3 討論與結(jié)論

土壤缺磷是限制豆科作物生產(chǎn)的重要因素[20-21]，適量的磷不僅能促進(jìn)植物的生長，還能促進(jìn)豆科作物結(jié)瘤固氮作用，在豆科植物上有“以磷促氮”的說法[22]。程鳳嫻[23]在試驗(yàn)中證明了磷對根瘤菌共生固氮起著重要的作用，磷能促進(jìn)根瘤菌的固氮活性。在大豆的研究中當(dāng)磷濃度為9.3～37.0 mg/L時(shí)，大豆的植株生長量、根瘤數(shù)、根瘤干重、固氮活性和氮積累量會大幅下降[17]。本研究不同磷處理對熱研2號柱花草接種不同根瘤菌后鮮重和含氮量的影響呈現(xiàn)低磷不利于熱研2號柱花草鮮重和含氮量的增加，中磷條件對柱花草鮮重和含氮量的促進(jìn)作用最大，隨磷濃度的增加柱花草的鮮重和含氮量反而降低的規(guī)律，但不同菌株的接種效果存在較大的差異。接種菌株YM11-1、LZ3-2、FS3-1-1、RJS9-2在磷濃度為150 μmol/L時(shí)有最大的鮮重，接種菌株BS1-1、CJ1、PN13-3在150～200 μmol/L都有最大的鮮重，接種菌株LZ3-2、FS3-1-1、RJS9-2、BS1-1、CJ1、PN13-3在150 μmol/L的含氮量最大。齊敏興等[24]在不同磷水平對接種根瘤菌紫花苜蓿生長特性影響的研究中也得到類似的結(jié)果，但熱研2號柱花草最佳磷水平的磷濃度較紫花苜蓿的（1 000 μmol/L）低。

不同根瘤菌對磷素的需求量及吸收利用力存在很大的差異，豆科植物接種根瘤形成共生系統(tǒng)，磷對共生系統(tǒng)的影響主要由磷對根瘤和對植株的影響構(gòu)成，研究結(jié)果表明：植物結(jié)瘤和保持固氮酶活性比正常生長需更多的磷[25-26]，但過高的磷會加大植株的呼吸強(qiáng)度，引起養(yǎng)分消耗，不利于植株的正常發(fā)育[27]。所以，根瘤菌高效固氮的條件篩選必須根據(jù)栽培目的選擇篩選的指標(biāo)，通過綜合分析確定使植株和根瘤都達(dá)到最佳生長狀態(tài)的磷濃度。本研究在通過鮮重和含氮量確定熱研2號柱花草接種不同根瘤菌的最佳磷濃度的基礎(chǔ)上，加入莖葉干重、固氮酶活性、莖葉氮含量、莖葉磷含量等指標(biāo)進(jìn)行主因子分析，得出不同菌株與熱研2號柱花草共生的最適磷濃度，菌株YM11-1、RJS9-2、PN13-3在磷濃度為200 μmol/L時(shí)對熱研2號柱花草有最好的固氮促生效果；菌株LZ3-2、BS1-1、CJ1在磷濃度為150 μmol/L條件下有最好的固氮促生效果；菌株FS3-1-1在磷濃度為150～200 μmol/L都有最好的固氮促生效果。

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