丹參酚酸類成分生物合成途徑研究進展

韓立敏

摘要 酚酸類成分是丹參的一大類活性成分，具有重要的生理意義，從丹參酚酸類成分的生理活性、生源途徑、生源途徑關鍵酶基因研究等方面進行了歸納總結，提出了有待深入研究解決的問題，為丹參酚酸成分的生物合成及其調(diào)控研究奠定基礎。

關鍵詞 丹參；酚酸類成分；生物合成；關鍵酶基因

中圖分類號 S188 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2014）20-06562-03

丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，以其干燥根及根莖入藥，具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩等功效[1]。丹參的生理活性成分按其溶解性的不同分為兩大類：一類是脂溶性成分，另一類是水溶性成分。丹參酮 I、丹參酮 IIA、丹參酮 IIB、隱丹參酮、丹參酸甲酯、紫丹參素等均屬脂溶性成分；丹參的水溶性成分主要是指一些酚酸類化合物，包括丹參素、紫草酸、丹酚酸B和迷迭香酸等[2]。鑒于中醫(yī)傳統(tǒng)用藥方法是用其水煎劑，即丹參的水溶性部位，因此，研究丹參水溶性成分的生物合成及其代謝調(diào)控具有重要意義，成為近年來的研究熱點。

1 丹參酚酸類化合物的藥理活性

丹參水溶性酚酸類成分具有重要藥理作用，尤其是迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A和丹酚酸B，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，丹參的水溶性成分具有抗炎、抗菌、抗血栓、改善微循環(huán)、促進組織恢復、抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基等多種生理活性，在抗肝臟損傷、抗動脈粥樣硬化等方面具有一定的療效[3-5]。因此，丹參酚酸類成分是極具價值的藥用資源，蘊藏著巨大的市場潛力，為更好地利用這一資源，闡明它們的生物合成途徑并應用于實際生產(chǎn)具有重要意義。

2 丹酚酸類成分的生物合成途徑

早在1993年，PETERSEN等[6]利用彩葉草的懸浮培養(yǎng)細胞，第一次比較全面地闡述了迷迭香酸的生源途徑及途徑上相關酶，丹參中的主要水溶性酚酸類成分在結構上與其具有相似性，大部分都是在迷迭香酸的結構上進一步衍生化得到，因此在生源途徑上也應有一定的關聯(lián)，但具體的生源途徑尚不完全清楚。目前普遍認為，丹參酚酸類次生代謝物主要合成于兩條代謝途徑——苯丙烷代謝途徑和迷迭香酸代謝途徑（圖1A）[7]，ZHANG等[8]研究了丹參毛狀根在茉莉酸甲酯和真菌提取物處理下丹酚酸合成途徑關鍵酶基因的響應情況，認為酪氨酸途徑與迷迭香酸的合成相關性更大[8]。2012年上海第二軍醫(yī)大學邸鵬[9]利用13C同位素標記動態(tài)監(jiān)測的方法對迷迭香酸生源途徑進行了重新評估，認為咖啡酰CoA與4羥基苯乳酸在丹參迷迭香酸合成酶（SmRAS）催化下生成咖啡酸4羥基苯乳酸，顛覆了之前人們對此途徑的認識（圖1B）。2013年，陜西學前師范學院植物次生代謝課題組對丹參酚酸類成分的合成途徑再次進行了修正，SmRAS催化4香豆酰CoA與丹參素合成4香豆酰3，4二羥基苯乳酸，而后在丹參細胞色素P450酶（SmCYP98A14）的作用下轉(zhuǎn)化為迷迭香酸，再經(jīng)過多步反應生成丹酚酸B（圖1C）[10]。

關于丹參酚酸類成分生源途徑，人們認識比較清楚的是迷迭香酸的上游，但迷迭香酸代謝通路還有不確定的步驟，即SmRAS底物和產(chǎn)物，對此仍需進一步研究證實。丹酚酸B如何由迷迭香酸轉(zhuǎn)化而來目前仍不清楚，研究成果很少，從迷迭香酸到丹酚酸B的代謝通路研究有待突破。

3 丹參酚酸類化合物生物合成途徑上相關酶基因

3.1 苯丙氨酸解氨酶基因（SmPAL）

苯丙氨酸裂解酶（phenylalanine ammonialyase EC 4.3.1.24）是催化苯丙烷類代謝第一步反應的酶，是苯丙烷類化合物代謝的關鍵酶和限速酶。在丹參迷迭香酸生源途徑中 PAL 是丹參從初生代謝途徑向次生代謝途徑進入的位點酶和限速酶[11]。

SONG等[12]將丹參苯丙氨酸解氨酶基因（SmPAL）干涉后發(fā)現(xiàn)丹參中迷迭香酸和丹酚酸 B 的含量顯著下降，且植株的表型發(fā)生變化，從而證實了 PAL 在迷迭香酸合成過程中的重要性。之后，人們對丹參苯丙氨酸解氨酶基因的功能及其表達調(diào)控進行了大量研究。MeJA處理可以顯著提高SmPAL酶活性，促進丹參培養(yǎng)細胞中迷迭香酸（RA）的生物合成[13]。適宜濃度的 Ca2+處理可以通過影響迷迭香酸合成途徑中關鍵酶 PAL 活性從而顯著提高丹參培養(yǎng)細胞中迷迭香酸的合成積累量[14]。水楊酸（SA） 處理可有效誘導丹參培養(yǎng)細胞中PAL活性升高以及丹酚酸B 的合成與積累[15]，但SmPAL受熱脅迫影響表達量下降[16]。

圖1 丹參酚酸類成分的生物合成途徑

3.2 肉桂酸4羥化酶基因（SmC4H）

肉桂酸 4羥化酶（cinnamate 4monooxygenase EC 1.14.13.11 ）是一種 P450 單加氧酶，是第一個被克隆并確定了功能的植物 P450[17]。其催化苯丙烷途徑中4肉桂酸向4香豆酸轉(zhuǎn)化，催化反式肉桂酸對位羥基化，與下游產(chǎn)物如木質(zhì)素、類黃酮等許多代謝物的合成有關。研究表明，在丹參毛狀根中過量表達SmC4H能夠顯著提高丹酚酸 B 的含量[18]，而熱脅迫導致SmC4H表達量下降，丹參中的迷迭香酸和丹酚酸B含量下降[15]。在大腸桿菌BL21中表達 SmC4H基因，重組蛋白誘導表達效果較好，但主要以包涵體形式存在[19]。

3.3 4香豆素輔酶A連接酶基因（Sm4CL）

4香豆酸：輔酶 A 連接酶（4Coumarate：CoA ligase EC 6.2.1.12）催化肉桂酸及其衍生物產(chǎn)生相應的CoA 酯，為植物苯丙氨酸途徑中的關鍵酶。在丹參中該酶的編碼基因Sm4CL 以基因家族形式出現(xiàn)，研究較多的是Sm4CL1 和Sm4CL2[20]。對2個Sm4CL和不同底物的親和性試驗表明，Sm4CL1 對香豆酸親和性較高，Sm4CL2 對咖啡酸親和性較高，這也與化合物在不同細胞器及不同時間段積累有關。熱脅迫條件下Sm4CL表達量呈先上升后下降趨勢[15]。

3.4 酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因（SmTAT）

酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（tyrosine aminotransferase EC：2.6.1.5）是酪氨酸途徑上的第一個關鍵酶，可將酪氨酸轉(zhuǎn)化為 4羥基苯丙酮酸。目前已從多種植物中克隆得到TAT基因，如丹參、彩葉草、大豆、苜蓿和擬南芥[21-22]。

丹參 SmTAT 基因序列包含 6 個外顯子和 5 個內(nèi)含子，其啟動子和終止子包含多個基因調(diào)控元件。該基因在丹參根、莖、葉中均有表達，且莖中的表達比葉和根高。熱脅迫、茉莉酸甲酯、脫落酸、水楊酸和紫外照射處理分別在一定程度上上調(diào)SmTAT 轉(zhuǎn)錄水平的表達，研究表明，丹參毛狀根中過量表達SmTAT 能夠顯著提高迷迭香酸的積累，改變迷迭香酸和丹酚酸 B 的構成比例[18]。焦蒙麗等[23]研究了水楊酸對丹參酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的影響并探討了影響其酶活性的分子機制。

3.5 羥苯基丙酮酸還原酶基因（SmHPPR）

對羥基苯丙酮酸還原酶（hydroxyphenylpyruvate reductase.EC 1.1.1.237） 是迷迭香酸生物合成途徑中第一個使代謝流特異流向迷迭香酸的關鍵酶[24]。KIM 等[24]對彩葉草懸浮細胞中的 HPPR 蛋白進行分離純化，并克隆得到該物種中的 HPPR 全長 cDNA 序列，異源表達得到酶蛋白，該蛋白既可催化對羥基苯丙酮酸轉(zhuǎn)成對羥基苯乳酸，又可催化 3，4二羥基苯丙酮酸轉(zhuǎn)化成3，4二羥基苯乳酸。SmHPPR在丹參根莖葉均有表達，莖中最強，根次之，葉表達量最少，該基因受茉莉酸、脫落酸、水楊酸及活性氧族信號的調(diào)控，其轉(zhuǎn)錄表達水平受MeJA、SA、ABA 和赤霉素上調(diào)，UVB 和雙氧水處理能下調(diào)其轉(zhuǎn)錄表達水平[25]，在熱脅迫處理下SmHPPR表達量前期變化不大，后期呈下降趨勢。在丹參毛狀根中，過量表達SmHPPR 及共表達 SmTATSmHPPR 均能顯著提高迷迭香酸和丹酚酸 B 的含量[18]。

3.6 迷迭香酸合成酶基因（SmRAS）

迷迭香酸合成酶（rosmarinate synthase EC：2.3.1.140））首次分離于彩葉草[26]，目前研究較少，只有彩葉草、熏衣草和蜜蜂花中的迷迭香酸合成酶有報道[27-28]。迷迭香酸合成酶將 4香豆酰 CoA 與 4羥基苯乳酸共同催化生成 2氧（4香豆酰）3（4羥基苯）-乳酸，這是迷迭香酸生物合成的關鍵步驟?，F(xiàn)已從丹參中得到迷迭香酸合成酶基因，并對其表達調(diào)控和功能進行了初步研究。SmRAS（ADA60182）編碼 428個氨基酸，其在根中表達最高，莖中次之，葉中的表達最低，SmRAS 的表達受茉莉酸甲酯的調(diào)控，茉莉酸甲酯處理10 h 其表達量達到最高，為初始表達水平的 10 倍左右，而后至 24 h下降到初始表達水平的 5 倍左右。構建SmRAS RNAi載體，轉(zhuǎn)至丹參毛狀根中，基因的表達干涉使得丹參毛狀根中的酚酸類成分積累受到明顯影響，下降最明顯的I5株系的迷迭香酸和丹酚酸B分別為對照的20%和30%，初步闡述了該基因在丹參酚酸類成分合成中的作用[9]。

RAS是一個多基因家族，目前只研究了一條SmRAS，2013年9月NCBI上公布了5條新的SmRAS家族成員，目前已全部克隆得到。對比6條SmRAS基因編碼的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，它們在RAS特有的肽段DEDYL上有很大差異，SmRAS2、SmRAS3、SmRAS4和SmRAS6在該處的氨基酸是NDEL，SmRAS1在該處的氨基酸是DEDYL，而SmRAS5的是KDEYL[29]，因此，到底哪一條SmRAS4在丹參迷迭香酸的生物合成中貢獻最大，SmRAS的關鍵催化活性位點還有待于進一步深入研究。

3.7 細胞色素P450酶基因（SmCYP98A14）

CYP98A14（coumaroyl 3′monooxygenase EC：1.14.13.36）是細胞色素 P450 酶，在迷迭香酸合成過程中將 SmRAS 催化 4香豆酰 CoA 與 4羥基苯乳酸生成的 2氧（4香豆酰）3（4羥基苯）乳酸在 3 位和 3位添加羥基從而生成迷迭香酸。

目前已經(jīng)從彩葉草中分離得到 CYP98A14 基因并驗證了功能[30]。邸鵬[9]克隆了SmCYP98A14，對其組織表達特異性和表達調(diào)控進行了研究，通過該基因的干涉和過表達初步研究了其在植物體內(nèi)的功能。SmCYP98A14（HQ316179）開放閱讀框（ORF）包含1 527 bp ，編碼 508 個氨基酸。其在根中表達量最高，葉中次之，莖中極低。用脫落酸和茉莉酸甲酯處理丹參，發(fā)現(xiàn)SmCYP98A14的表達受 ABA 影響非常顯著，在 2 h 時表達相對于空白提升了 40 倍，隨后在 4 h下降到初始水平左右。同時SmCYP98A14受茉莉酸甲酯調(diào)控，2 h表達達到最大值，為對照的15 倍左右，從4 h 開始逐漸下降，于 12 h 降至初始水平，而后又有小幅上升。通過反義干擾和RNAi技術抑制 SmCYP98A14 的表達對丹參中酚酸類成分積累有明顯的影響[9]。

3.8 NADH細胞色素P450還原酶酶基因（SmCPR）

SmCPR 是一類 NADPH細胞色素 P450 還原酶，它能夠提高 SmCYP98A14 對底物的催化效率。SmCPR（FR693803）開放閱讀框（ORF）2 118 bp，編碼 705個氨基酸，其在根莖葉的表達較接近。 SmCPR 基因的表達受 ABA 影響，在 2 h 時表達相對對照提高 8倍，隨后均在 4 h 下降到初始水平左右。SmCPR的表達受甲基茉莉酸調(diào)控，處理 2 h表達達到最大值（為初始表達的 20 倍左右），4 h 后逐漸下降，在 12 h 時降至初始水平，而后又有小幅上升[9]。

4 研究展望

為了提高品質(zhì)、滿足市場需求，利用基因工程、細胞工程等現(xiàn)代生物技術手段對丹參進行改良以提高其藥材有效成分的含量愈來愈受到人們的重視，許多基于毛狀根培養(yǎng)、愈傷組織培養(yǎng)、細胞培養(yǎng)的方法被用于提高丹參中水溶性酚酸類物質(zhì)的含量。目前，丹參功能基因組研究已經(jīng)全面展開，丹參次生代謝骨架途徑已經(jīng)基本明了，隨著分子生物學與基因工程技術的不斷發(fā)展，利用整合分子生物學、轉(zhuǎn)錄組學、代謝組學等研究技術與手段，揭示代謝網(wǎng)絡中能量利用和代謝流分配的規(guī)律，闡明丹參重要活性成分生物合成調(diào)控機制，使人們對丹參酚酸類成分的研究與認識越來越深入，并使得利用關鍵酶基因在模式微生物中進行異源表達來生產(chǎn)丹酚酸類成分成為可能。這將有效地解決丹參植物資源短缺的問題，并對于進一步高效開發(fā)利用丹參資源具有重要意義。

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