高速逆流色譜法制備分離庫拉索蘆薈中的2’—對香豆酰蘆薈寧

吳小芳等

摘 要 采用高速逆流色譜法分離純化庫拉索蘆薈中的2-對香豆酰蘆薈寧。以正己烷-乙酸乙酯-丙酮-水（1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 5，V/V/V/V）為溶劑體系，上相為固定相，下相為流動相，線圈轉(zhuǎn)速為860 r/min，流速為2 mL/min，紫外檢測波長為300 nm，一次進樣85 min內(nèi)從487.5 mg庫拉索蘆薈丙酮提取物中分離得到19.5 mg單體組分，經(jīng)高效液相色譜分析，測定純度為95.6%（峰面積百分比），通過質(zhì)譜、紅外、紫外和核磁技術(shù)進行結(jié)構(gòu)鑒定，確定組分為2-對香豆酰蘆薈寧。該法具有操作簡便、速度快、樣品制備量大、節(jié)省溶劑及回收率高等優(yōu)點，可為蘆薈寧類化合物的分離提供高效、穩(wěn)定及可靠的方法。

關(guān)鍵詞 高速逆流色譜；庫拉索蘆薈；2-對香豆酰蘆薈寧；分離純化

中圖分類號 O567；S567.2 文獻標(biāo)識碼 A

Isolation and Purification of Aloenin-2-p-coumaroyl

Ester from Aloe barbadensis Mill by High-speed

Counter-current Chromatography

WU Xiaofang1，2， WAN Jinzhi3 *， ZHONG Jiasheng3， LUO Jinhui1，2， LI Shuhuai1，2， ZHANG Qun1，2

1 Analysis and Testing Center， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

2 Hainan Provincial Key Laboratory of Quality and Safety for Tropical Fruits and Vegetables， Haikou， Hainan 571101， China

3 School of Pharmaceutical Sciences， Sun Yat-Sen University， Guangzhou， Guangdong 510006， China

Abstract Aloenin-2-p-coumaroyl ester was separated and purified from Aloe barbadensis Mill by one step of high-speed counter-current chromatography. The separation was performed with an optimized two-phase solvent system composed of hexane-ethyl acetate- acetone-water（1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 5， V/V/V/V）， using the lower phase as the mobile phase in the head-to-tail elution mode. The revolution speed of the separation column， flow rate of the mobile phase， and UV detection wavelength was 860 rpm， 2.0 mL/min and 300 nm， respectively. In a one-step operation within 85 min， 19.5 mg of aloenin-2-p-coumaroyl ester could be obtained from 487.5 mg of dried acetone extract at purities of 95.6%， as determined by HPLC using area normalization method. The structure of the compound was identified by high resolution mass spectroscopy（HRMS）， UV， IR and NMR. It is simple， fast and it eliminates the irreversible loss of samples， resulting in a higher recovery and larger scale of products than conventional techniques. This experiment gives an efficient， stable and reliable technique to prepare high pure aloenin nature products.

Key words High-speed counter-current chromatography； Aloe barbadensis Mill； Aloenin-2'-p-coumaroyl ester； Isolation and purification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.08.031

高速逆流色譜（HSCCC）是由美國伊藤博士（Ito.Y.）[1]研發(fā)的一種高效快速的液液分配色譜技術(shù)，無固定相支撐，將作為固定相的溶劑輸入離心機的螺旋管里，另一相作為流動相恒速泵入，利用螺旋柱在高速行星運動時產(chǎn)生的一種離心力，使螺旋柱中互不相溶的兩相不斷混合，其中的樣品在兩相溶劑體系的混合分離之間不斷進行分配，依據(jù)分配系數(shù)的大小次序被依次洗脫，從而實現(xiàn)分離。相對于傳統(tǒng)的柱色譜技術(shù)，HSCCC具有適用面廣、高效、快速、制備量大及費用低等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于生物工程、醫(yī)藥、天然產(chǎn)物、合成及環(huán)境等領(lǐng)域[2]。現(xiàn)在HSCCC法正在發(fā)展成為一種備受關(guān)注的分離純化技術(shù)，向著微型化、聯(lián)用化、工業(yè)化等方向迅速發(fā)展。

蘆薈是百合科（Liliaceae）蘆薈屬（Aloe）的多年生常綠肉質(zhì)草本植物。在蘆薈500多類品種中，庫拉索蘆薈為最常用的藥用蘆薈，其制品也廣泛應(yīng)用于日用化工、保健食品等多個領(lǐng)域[3]。國內(nèi)外多采用硅膠柱層析等傳統(tǒng)柱色譜分離方法對庫拉索蘆薈的化學(xué)成分已經(jīng)進行了廣泛的研究[4-7]，確定其二級代謝產(chǎn)物主要是色酮類、蒽酮類和吡喃酮類等成分，但分析耗時較長且效率低，不利于單體化合物的大量制備。本課題組經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，2-對香豆酰蘆薈寧是庫拉索蘆薈藥材中含量最高的吡喃酮類化合物[8]。關(guān)于該化合物的藥理作用目前尚未見報道，為了給該化合物后期的藥效研究提供高純度的單體化合物，本課題組[9]曾報道過同時制備蘆薈苷、異蘆薈色苷D和2-對香豆酰蘆薈寧的高速逆流色譜法，但此法制備分離2-對香豆酰蘆薈寧的時間長達250 min。本研究直接針對2-對香豆酰蘆薈寧，采用高速逆流色譜法，通過優(yōu)化溶劑體系，在短時間內(nèi)制備出高純度的單體化合物，為大規(guī)模制備2-對香豆酰蘆薈寧提供更為便捷的方法，也為HSCCC分離相似的化合物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 庫拉索蘆薈藥材粉由云南元江萬綠生物有限公司提供，批號：20120301，并經(jīng)中山大學(xué)藥學(xué)院徐新軍副教授鑒定。

1.1.2 儀器 MK5 QuilkPrep500高速逆流色譜儀（英國AECS公司；配有SSI series II 恒流泵，島津SPD-10AVP檢測器，N2000數(shù)據(jù)工作站，BS-100A自動餾分收集器，10 mL定量環(huán)，四組聚四氟乙烯線圈：管直徑2.16 mm，β值為0.5～0.8，總體積為450 mL，使用體積為115 mL），LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司，配有二極管陣列檢測器DAD），高效液相色譜/電噴霧-離子阱-飛行時間質(zhì)譜（日本島津公司），Tensor 37型傅立葉變換紅外光譜儀（德國Bruker公司），Bruker Avance AV 400核磁共振波譜儀（德國Bruker公司），AB135-S型十萬分之一天平（瑞士梅特勒公司），RE3000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），SB25-12D型超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.1.3 試劑 自填充制備色譜柱（日本富士硅化工有限公司；柱填料為Chromatorex SMB ODS，300 mm×20 mm，20～40 μm），氘代甲醇和氘代吡啶（美國Sigma-Aldrich公司），甲醇（色譜純，美國Honeywell Burdick & Jackson公司），甲醇（分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠），乙醇（工業(yè)純，天津大茂化學(xué)試劑廠），怡寶純凈水（怡寶食品飲料有限公司），二級蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

（1）庫拉索蘆薈粗提物的制備。稱取100.0 g干燥的庫拉索蘆薈藥材粉末，置于1 000 mL 燒杯中，加入500 mL丙酮，攪勻，超聲30 min后離心，重復(fù)操作5次，收集上層清液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀60 ℃回收溶劑，所得浸膏于真空干燥箱40 ℃減壓干燥，得到棕色有光澤的庫拉索蘆薈丙酮粗提物粉末，密封保存在4 ℃中，備用。

（2）HPLC分析樣品的制備。為了減少丙酮等溶劑對色譜峰的影響，將HSCCC收集的餾分蒸干溶劑后，重新加入50%甲醇-水復(fù)溶，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜濾過，濾液用于HPLC純度分析。

1.2.2 分離溶劑系統(tǒng)的選擇 良好溶劑系統(tǒng)的選擇，是實現(xiàn)HSCCC 制備分離的關(guān)鍵因素。兩相溶劑系統(tǒng)合適與否是由樣品中各組分在其中的分配系數(shù)以及固定相的保留率來衡量，一般認為分配系數(shù)K在0.5～2.0的范圍內(nèi)是比較合適，并且各組分的分配系數(shù)數(shù)值要有足夠差異，分離因子最好大于或等于1.5，固定相保留率在50%以上[1]。采用 HPLC 測定樣品中目標(biāo)化合物在溶劑體系中的分配系數(shù)（K值），測定過程：稱取約2 mg庫拉索蘆薈藥材粗提物置于10 mL試管中，加入預(yù)先達到分配平衡的兩相溶劑系統(tǒng)的上下相溶液各2 mL溶解樣品，劇烈振蕩，靜置，使其充分溶解，待兩相達到分配平衡后，分別取等體積的上相、下相溶液（各1 mL），蒸干溶劑后，重新用等體積50%甲醇-水溶解，按2.4項下色譜條件，采用 HPLC 法測定上、下層所含目標(biāo)成分的濃度，即可求得目標(biāo)成分在該溶劑系統(tǒng)中的分配系數(shù)。結(jié)合前期研究成果和實驗積累的經(jīng)驗[9]，選擇正己烷-乙酸乙酯-丙酮-水（1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 5，V/V/V/V）溶劑系統(tǒng)，配制一定量的兩相溶劑，靜置分層。

1.2.3 HSCCC的分離制備 兩相溶劑系統(tǒng)采用正己烷-乙酸乙酯-丙酮-水（1 ∶ 5 ∶ 1 ∶ 5，V/V/V/V），采用單線圈、頭接尾的洗脫方式，上相作為固定相，固定相溶液以 8.0 mL/min的流速泵入HSCCC螺旋管中，當(dāng)螺旋管完全充滿后，主機正轉(zhuǎn)，調(diào)節(jié)線圈轉(zhuǎn)速為860 r/min，下相作為流動相以2 mL/min流速泵入螺旋管中。待流動相流出，兩相溶劑在柱中達到分配平衡狀態(tài)，此時測量被流動相推出的固定相體積V出，按下式計算固定相保留率（固定相保留率ρ必須>40%，否則該溶劑系統(tǒng)不適用）。取487.5 mg庫拉索蘆薈粗提物樣品溶于等體積的上下相中（共8 mL），超聲助溶，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，作為HSCCC進樣樣品，通過六通閥進樣。采用紫外檢測器對餾分進行檢測，檢測波長為300 nm，同時記錄色譜圖，自動餾分收集器根據(jù)色譜圖自動收集餾分，每2 min收集一管，采用HPLC峰面積歸一化法測定峰純度，根據(jù)HSCCC色譜圖和HPLC-DAD純度分析結(jié)果合并相同純度的同一組分，干燥后保存在4 ℃中，備用。

（2）HSCCC分離峰組分的鑒別。HSCCC分離峰組分通過紫外（UV）、紅外（IR）、高分辨率質(zhì)譜（HRMS）和核磁（NMR）技術(shù)進行結(jié)構(gòu)鑒定。干燥的HSCCC峰餾分溶于甲醇后經(jīng)HPLC-DAD（200～800 nm）掃描化合物的紫外最大吸收波長。取1～2 mg干燥的HSCCC的峰組分與KBr壓制成片，經(jīng)傅里葉紅外光譜儀檢測化合物的IR光譜。將HSCCC收集的峰餾分蒸干溶劑后，重新加入50%甲醇-水復(fù)溶，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜濾過，濾液用于高HRMS分析，HRMS質(zhì)譜檢測采用電噴霧（ESI源）離子源，采用負離子化模式檢測，負離子模式噴霧電壓為 -3.5 kV，母離子根據(jù)離子強度自動選擇，MS的質(zhì)量范圍為m/z 100～1 000，曲形脫溶劑管（CDL）溫度為200 ℃，飛行管電壓為-7.0 kV，加熱模塊（BH）溫度為200 ℃，檢測器電壓為1.56 kV。取約20 mg干燥的HSCCC組分溶于0.5 mL的氘代甲醇中，用于化合物的1H和13C核磁分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HSCCC分離結(jié)果

在本試驗所建立的最佳色譜條件下，固定相保留率為73.9%，進樣487.5 mg進行分離，分離85 min，HSCCC 圖譜見圖1。收集峰60～78 min處對應(yīng)的流出液，減壓濃縮，50 ℃減壓干燥，得到19.5 mg的化合物。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定與純度測定

2.2.1 HSCCC分離峰的結(jié)構(gòu)分析 HSCCC分離峰獲得的單體化合物為淡黃色無定型粉末，分子式為C28H28O12，HRMS（ESI） m/z：555.153 8[M-H]-（計算值555.150 8），見圖2；采用HPLC-DAD聯(lián)用技術(shù)，觀察到UV λmax nm：205，225，311，說明化合物有較長的共軛系統(tǒng)，見圖7；IR（KBr）νmax cm-1：3 384，1 698，1 690，1 635，1 604，1 559，見圖3；NMR數(shù)據(jù)見表1、圖4及圖5，1H-NMR顯示一套AA′BB′系統(tǒng)的氫信號[δH 7.47（2H，d，J=8.5 Hz， H-5″，H-9″），6.82（2H，d，J=8.5 Hz， H-6″，H-8″）]，以及一對反式雙鍵氫信號[δH 7.56（1H， d， J=16.0 Hz， H-3″），6.24（1H， d， J=16.0 Hz， H-2″）]，結(jié)合13C-NMR譜顯示的羰基碳信號 δC 168.4（C-1″）推測分子結(jié)構(gòu)中存在1個反式香豆酰基團。同時，NMR還顯示1個β-D-葡萄糖信號[1個芳香氫信號δH 5.06（d， J=8.0 Hz， H-1″）；6個次甲基信號δC 100.9，76.2，74.5，

71.5，78.5和62.6]，推測該化合物是1個β-D-葡萄糖苷；另外，NMR還提示該化合物為蘆薈寧衍生物[1H-NMR譜中兩對間位偶合的氫信號δH 6.62（1H， d， J=2.0 Hz， H-9）， 6.40（1H， d， J=2.0 Hz， H-11），5.98（1H， d， J=2.2 Hz， H-5），5.54（1H，d， J=2.2 Hz， H-3）；13C-NMR譜中1個羰基碳信號（δC 167.9）和10個芳碳信號（δC 89.3， 173.7， 106.7， 158.8， 115.1， 158.1， 101.6， 161.4， 112.4， 141.1）]。此結(jié)果與文獻報道的基本一致[4]；確定分離峰的目標(biāo)化合物為2-對香豆酰蘆薈寧（aloenin-2-p-coumaroyl ester），為蘆薈寧類代謝產(chǎn)物。結(jié)構(gòu)式見圖6。

2.2.2 HPLC純度分析結(jié)果 采用HPLC-DAD檢測分離峰純度（2-對香豆酰蘆薈寧），經(jīng)峰面積歸一化法[10-12]，計算可知2-對香豆酰蘆薈寧純度為95.6%，HPLC色譜圖（檢測波長為300 nm）和HPLC三維光譜圖見圖7。

3 討論與結(jié)論

應(yīng)用高速逆流色譜法從庫拉索蘆薈中分離提純蘆薈寧類代謝產(chǎn)物的文獻報道甚少。前期報道文獻中蘆薈寧類化合物一直是經(jīng)有機溶劑反復(fù)提取和柱層析的梯度洗脫才能得到純度較高的化合物[4-7]，對于植物中微量有效成分來說，柱層析方法成本較高，步驟繁瑣，耗時長。本研究采用HSCCC技術(shù)，首次在85 min內(nèi)快速制備得到純度為95.6%的單體成分2-對香豆酰蘆薈寧，該法制備量大、分離能力強，且用時短，比本課題組曾報道過分離2-對香豆酰蘆薈寧的HSCCC法時間更短，為大規(guī)模制備2-對香豆酰蘆薈寧提供更為便捷的方法，也為HSCCC分離相似的化合物提供實施例和可參考的技術(shù)，分離得到的化合物可應(yīng)用于藥理活性等相關(guān)研究。

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