豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)方法的建立

陳星瑤 張子群 王曉龍

摘 要：豬細(xì)小病毒（Porcine Parvoviru，PPV）屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬，通常感染初產(chǎn)母豬后會(huì)發(fā)生流產(chǎn)、不孕、產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等病狀。該病廣泛存在于世界各地并在大多數(shù)豬場(chǎng)流行，中國(guó)PPV的感染也很廣泛。因此本研究針對(duì)VP2基因作為靶序列設(shè)計(jì)引物，旨在建立一種可快速、靈敏、特異地檢測(cè)PPV 的LAMP 檢測(cè)方法。

關(guān)鍵字：豬細(xì)小病毒；環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

Establishment of Loop-mediated Isothermal Amplifi

-cation for Detection of Porcine Parvoviru

Chen Xingyao1， Zhang Ziqun2， Wang Xiaolong1*

（ 1.Center of Conservation Medicine & Ecological Safety， Northeast Forestry University， Harbin， Heilongjiang， 150040；

2. Heilongjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau， Harbin， Heilongjiang， 150000）

Abstract： Porcine Parvoviru（PPV） belongs to the genus of parvovirus and the family of parvovirus. It can infect primiparous sow and usually result to abortion， infertility， stillbirth， malformation， mummification and weaking piglet and so on. This disease is popular in most pig farms and is widespread around the world. Meanwhile Chinese PPV infection is also very extensive. We designed primers according to VP2 gene of PPV， and established a quick， sensitive and specific detection method of LAMP for PPV .

Keywords： Porcine Parvoviru； 1oop-mediated isothermal amplification（LAMP）

豬細(xì)小病毒（Porcine Parvoviru，PPV）屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬。豬細(xì)小病毒粒子直徑約18～26 nm，外觀呈三角形或圓形，沒(méi)有囊膜。成熟的病毒粒子基因組為單股負(fù)鏈DNA分子，大約5 000個(gè)堿基[1]。豬細(xì)小病毒主要引起豬繁殖障礙，通常會(huì)導(dǎo)致初產(chǎn)母豬發(fā)生流產(chǎn)、不孕、 產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等病狀發(fā)生[2， 3]。該病廣泛存在于世界各地并在大多數(shù)豬場(chǎng)流行，嚴(yán)重地影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。豬細(xì)小病毒在中國(guó)已經(jīng)普遍存在和傳播。調(diào)查顯示中國(guó)很多地區(qū)均有PPV的感染，比如黑龍江省[4]、河南省[5]、華中地區(qū)[6]、湖北省[7]、廣西省[8]、廣東省[9]等地區(qū)均有細(xì)小病毒感染的報(bào)道。 因此急需建立一種快速、便捷、靈敏且特異地PPV檢測(cè)方法。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP，1oop-mediated isothermal amplification） 是2000 年由日本的Notomi 等人發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法[10]。該技術(shù)具有特異性高、操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性好、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，在一些病原的檢測(cè)中已被廣泛應(yīng)用[11， 12]。PPV有三種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3，其中VP3是VP2水解后的產(chǎn)物，而VP2完全重疊于VP1中。本研究根據(jù)LAMP的工作原理，以VP2基因?yàn)槟繕?biāo)基因，在優(yōu)化相關(guān)反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上，建立了適用于臨床應(yīng)用的豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)方法，以期為我國(guó)豬細(xì)小病毒的防控提供必要的技術(shù)方法。

1材料和方法

1.1病毒來(lái)源

豬細(xì)小病毒基因組、豬圓環(huán)病毒2型基因組、豬鏈球菌基因組、豬繁殖與呼吸綜合征基因組、豬水泡病病毒基因組、偽狂犬病毒基因組、豬瘟病毒cDNA、豬流感cDNA、口蹄疫O型cDNA、豬藍(lán)耳病cDNA由本單位分離并保存。

1.2主要試劑及儀器

Marker（DL2000，DL100）購(gòu)自大連TaKaRa公司，dATP，dTTP，dCTP，dGTP均購(gòu)買自大連寶生物公司。Bst DNA聚合酶，瓊脂糖，甜菜堿，鎂離子購(gòu)自購(gòu)自NEB公司；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。電子天平購(gòu)自瑞士precisa公司；旋渦混合器購(gòu)自北京金北德工貿(mào)有限公司；高速離心機(jī)和高速冷凍離心機(jī)均購(gòu)自德國(guó)Kandro公司；PCR儀為美國(guó)Thermal Cycler公司的MJ—PTC200型；制冰機(jī)購(gòu)自日本SANYO公司；微波爐購(gòu)自海爾集團(tuán)；DYY-6C型瓊脂糖水平電泳儀購(gòu)自北京市六一儀器廠；紫外凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自香港Gene公司；濕熱滅菌器購(gòu)自日本SANYO公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購(gòu)自上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；冰箱購(gòu)自三星公司。

1.3引物設(shè)計(jì)及制備

應(yīng)用網(wǎng)上lamp引物設(shè)計(jì)軟件（PrimerExplorerV3）對(duì)VP2基因設(shè)計(jì)引物（圖 1）。從獲得的數(shù)百對(duì)引物中選擇評(píng)分較高的引物，將設(shè)計(jì)好的序列發(fā)送至南京金斯瑞生物工程有限公司進(jìn)行5'端修飾合成。

1.4 豬細(xì)小病毒LAMP檢測(cè)方法的建立

豬細(xì)小病毒陽(yáng)性樣本測(cè)序后測(cè)定濃度，分裝備用。

配制LAMP（2×）的反應(yīng)緩沖液： 1M Tris-HCl （pH8.8） 貯存液 40 mL，KCl 1.49 g ，MgSO4 1.93 g，（NH4）2SO4 2.64 g，Tween-20 2 mL，Betaine 187.4 g，將上述試劑混合后加入ddH2O定容至900 mL，混勻后取900 μL。再加入100 μL的 25 mM dNTP混合液（dATP 25 μL、dCTP 25 μL、dGTP 25 μL、dTTP 25 μL）。

配制LAMP引物混合物（100 uM Primer stock）包括：FIP 20 μL，BIP 20 μL，F(xiàn)3 2.5 μL和B3 2.5 μL。

25 μL Lamp的反應(yīng)體系：Bst DNA 聚合酶1 μL，豬細(xì)小病毒DNA 2 μL，ddH2O 8.6 μL，2倍的反應(yīng)緩沖液12.5 μL，引物混合物0.9 μL。

1.5 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

反應(yīng)溫度優(yōu)化：根據(jù)反應(yīng)體系優(yōu)化策略，設(shè)置4組實(shí)驗(yàn)，分別為60℃，62℃，64℃及66℃，按1.4反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)時(shí)間為1 h，結(jié)束后各取2 μL樣品在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分析。

反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化：分別設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，時(shí)間分別為30 min，45 min和60 min，按1.4反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，反應(yīng)在62℃下進(jìn)行，結(jié)束后各取2 μL樣品在2%瓊脂糖凝膠中分析。

1.6 LAMP靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

將前述提取的豬細(xì)小病毒DNA進(jìn)行濃度測(cè)定，依次倍比稀釋成107～10-2個(gè)拷貝，按照1.4反應(yīng)條件檢測(cè)豬細(xì)小病毒LAMP引物的靈敏性。

1.7 LAMP特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

以豬圓環(huán)病毒2型，豬鏈球菌、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬水泡病病毒、偽狂犬病病毒，豬瘟病毒、豬流感病毒、O型口蹄疫病毒、豬藍(lán)耳病病毒和水作為供試樣品，制備DNA或cDNA作為模板，按照建立的方法進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，檢測(cè)豬細(xì)小病毒LAMP的特異性。

1.8染料可視化試驗(yàn)

為進(jìn)一步優(yōu)化LAMP的反應(yīng)條件，在LAMP反應(yīng)結(jié)束后，加入2 μLSYBR Green Ⅰ熒光染料觀察陰性和陽(yáng)性反應(yīng)顏色的變化情況。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

2.1.1溫度優(yōu)化

豬細(xì)小病毒LAMP引物溫度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中，擴(kuò)增60 min后核酸電泳檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，其中60℃，62℃，64℃和66℃均有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，陰性對(duì)

照無(wú)條帶產(chǎn)生，因此LAMP引物擴(kuò)增溫度可選擇60℃，62℃，64℃和66℃中任一溫度。

2.1.2時(shí)間優(yōu)化

豬細(xì)小病毒LAMP引物擴(kuò)增在60℃下擴(kuò)增不同時(shí)間的后核酸電泳檢測(cè)結(jié)果（圖3）。其中擴(kuò)增45 min、60 min后均有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生，30 min無(wú)條帶產(chǎn)生，因此可選擇LAMP反應(yīng)的擴(kuò)增時(shí)間為45 min。

2.2 LAMP靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

豬細(xì)小病毒LAMP引物擴(kuò)增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測(cè)結(jié)果，擴(kuò)增條件為60℃，擴(kuò)增時(shí)間為45 min。如圖4所示：107～101個(gè)拷貝的模板均有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生，其余無(wú)條帶產(chǎn)生，圖4可看出本研究所設(shè)計(jì)的LAMP引物在60℃下，擴(kuò)增45 min之后最少可檢出10個(gè)拷貝的模板。

2.3 LAMP特異性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

以豬細(xì)小病毒基因組為模板，使用LAMP引物在60℃下擴(kuò)增45 min后核酸電泳檢測(cè)結(jié)果。由圖5可見(jiàn)，豬細(xì)小病毒LAMP引物特異性擴(kuò)增出了豬細(xì)小病毒基因片段，而與其他病原并無(wú)交叉反應(yīng)。

2.4染料可視化試驗(yàn)

向LAMP引物擴(kuò)增不同濃度梯度基因的反應(yīng)產(chǎn)物管內(nèi)加2 μL SYBR GreenⅠ熒光染料，肉眼觀察，陽(yáng)性反應(yīng)管顏色立刻變?yōu)辄S綠色，且模板濃度不同顏色有深淺變化（圖6）。由此可見(jiàn)，LAMP 反應(yīng)結(jié)果容易判定，臨床推廣。

3結(jié)論

豬細(xì)小病毒基因組有兩個(gè)主要的開(kāi)放閱讀框架，其中3′端編碼結(jié)構(gòu)蛋白（VP）?；蚪M共編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白即VP1、VP2、VP3[13]。VP2蛋白完全重疊于VPI中，占總衣殼蛋白的60%以上是構(gòu)成病毒粒子的主要蛋白。在豬細(xì)小病毒 VP2蛋白的近N端有連續(xù)的9個(gè)甘氨酸，這種GGG樣的甘氨酸富集區(qū)折疊成A-螺旋結(jié)構(gòu)，可能是產(chǎn)生VP3蛋白的切割位點(diǎn)[14]。豬細(xì)小病毒VP2基因在759～917位點(diǎn)有連續(xù)158個(gè)堿基是PPV所特有的，而且強(qiáng)毒株和弱毒株此段基因序列完全相同[1， 15]。所以本研究選取針對(duì)其結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因的保守序列，設(shè)計(jì)合成特異性引物。

LAMP是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的基因擴(kuò)增技術(shù)，只需在恒溫條件下就能完成擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊儀器設(shè)備，并且擴(kuò)增結(jié)果可通過(guò)反應(yīng)體系的濁度或加入染料來(lái)直觀判斷，在病原檢測(cè)方面呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[10， 16]。LAMP技術(shù)可以保證擴(kuò)增的高特異性和高效率，其依賴于能夠識(shí)別靶DNA 上6個(gè)特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下擴(kuò)增核酸，能從僅相差一個(gè)核苷酸的基因標(biāo)本中找出相應(yīng)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增與否即可判斷目的基因是否存在。

綜合文中的試驗(yàn)結(jié)果，LAMP 檢測(cè)技術(shù)為豬細(xì)小病毒基因的診斷提供了一種快速、便捷且特異性強(qiáng)、敏感性高的檢測(cè)方法，可用于豬細(xì)小病毒臨床檢測(cè)，并具有非常良好的應(yīng)用前景。（編輯：何芳）

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