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    豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測方法的建立

    2014-04-29 00:44:03陳星瑤張子群王曉龍
    中國動(dòng)物保健 2014年9期
    關(guān)鍵詞:圓環(huán)條帶特異性

    陳星瑤 張子群 王曉龍

    摘 要:豬圓環(huán)病毒2型屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原。該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。目前針對(duì)PCV-2的檢測技術(shù)還有提升的空間,因此本研究針對(duì)PCV-2 的Cap 基因高度保守的區(qū)域作為靶序列設(shè)計(jì)引物,建立了一種可快速、靈敏、特異地檢測PCV-2 的LAMP 檢測方法。

    關(guān)鍵字:豬圓環(huán)病毒2型;環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)

    豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬,是20世紀(jì)末期被發(fā)現(xiàn)的單鏈負(fù)股DNA病毒,病毒粒子呈二十面體對(duì)稱,無囊膜,直徑大約17 nm。PCV-2是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原[1]。目前,該病在世界范圍內(nèi)的廣泛流行已經(jīng)給各國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。國內(nèi)經(jīng)過血清學(xué)和流行病學(xué)調(diào)查也證實(shí)了PCV-2感染非常嚴(yán)重[3-6]。2002年,由PCV-2感染引起的PMWS在全國各地爆發(fā)式流行,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。PMWS已成為我國規(guī)?;i場危害養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要免疫抑制性疫病之一[7]。當(dāng)下建立一種便捷、快速、特異的PCV-2檢測方法,以確保及時(shí)發(fā)現(xiàn)并采取有效措施控制PMSW的發(fā)生就顯得非常重要。

    環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(1oop-mediated isothermal amplification, LAMP)是2000 年由日本的Notomi 等人發(fā)明的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法[8]。由于LAMP具有反應(yīng)條件非常簡單、結(jié)果讀判方便,加之其敏感、特異、快速的優(yōu)點(diǎn),已被用于多種病原的檢測診斷[9, 10]。本研究針對(duì)PCV-2 的Cap 基因高度保守的區(qū)域作為靶序列設(shè)計(jì)引物,旨在建立一種可快速、靈敏、特異地檢測PCV-2 的LAMP 檢測方法.。

    1材料和方法

    1.1病毒來源

    豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征、偽狂犬病毒基因組以及豬瘟病毒cDNA、豬流感cDNA、口蹄疫cDNA、豬藍(lán)耳病cDNA由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。

    1.2主要試劑及儀器

    Marker(DL2000,DL100)購自大連TaKaRa公司,dATP,dTTP,dCTP,dGTP均購買自大連寶生物公司。Bst DNA聚合酶,瓊脂糖,甜菜堿,鎂離子購自NEB公司;其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.3引物設(shè)計(jì)及制備

    應(yīng)用網(wǎng)上Lamp引物設(shè)計(jì)軟件(PrimerExplorerV3)對(duì)Cap基因設(shè)計(jì)引物(圖1),從獲得的數(shù)百對(duì)引物中選擇評(píng)分較高的引物,送南京金斯瑞生物工程有限公司進(jìn)行5'端修飾合成。

    1.4 豬圓環(huán)病毒2型LAMP檢測方法的建立

    豬圓環(huán)病毒2型陽性樣本測序后測定濃度,分裝備用。

    配制LAMP(2×)的反應(yīng)緩沖液: 1M Tris-HCl (pH8.8) 貯存液 40 mL,KCl 1.49 g ,MgSO4 1.93 g,(NH4)2SO4 2.64 g,Tween-20 2 mL,Betaine 187.4g,將上述藥品混合后加入ddH2O定容至900 mL,混勻后取900 μL,再加入100 μL的 25 mM dNTP混合液(dATP 25 μL、dCTP 25μL、dGTP 25μL、dTTP 25μL)。

    配制LAMP引物混合物(100uM Primer stock)包括:FIP 20 μL,BIP 20 μL,F(xiàn)3 2.5 μL和B3 2.5 μL。

    25 μLLAMP的反應(yīng)體系:Bst DNA 聚合酶1 μL,豬圓環(huán)病毒2型DNA 2 μL,ddH2O 8.6 μL,2倍的反應(yīng)緩沖液12.5 μL,引物混合物0.9 μL。

    1.5 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

    反應(yīng)溫度優(yōu)化:根據(jù)反應(yīng)體系優(yōu)化策略,設(shè)置4組實(shí)驗(yàn),分別為60℃,62℃,64℃及66℃,按1.4反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn),反應(yīng)時(shí)間為1 h,結(jié)束后各取2 μL樣品在2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行分析。

    反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化:分別設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組,時(shí)間分別為30 min,45 min和60 min,按1.4反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn),反應(yīng)在62℃下進(jìn)行,結(jié)束后各取2 μL樣品在2%瓊脂糖凝膠中分析。

    1.6 LAMP靈敏度檢測實(shí)驗(yàn)

    將前述提取的豬圓環(huán)病毒2型DNA進(jìn)行濃度測定,依次倍比稀釋成107~10-2個(gè)拷貝,按照上述1.4反應(yīng)條件檢測豬圓環(huán)病毒2型LAMP引物的靈敏性。

    1.7 LAMP特異性檢測實(shí)驗(yàn)

    以豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬流感病毒、口蹄疫病毒、豬藍(lán)耳病病毒和水,制備DNA或cDNA作為模板,按照建立的方法進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,檢測豬圓環(huán)病毒2型LAMP的特異性。

    1.8染料可視化試驗(yàn)

    為進(jìn)一步優(yōu)化LAMP的反應(yīng)條件,在LAMP反應(yīng)結(jié)束后,加入2 μLSYBR Green Ⅰ熒光染料觀察陰性和陽性反應(yīng)顏色的變化情況。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

    2.1 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

    2.1.1溫度優(yōu)化

    豬圓環(huán)病毒2型LAMP引物溫度優(yōu)化中,擴(kuò)增60 min后電泳檢測結(jié)果如圖2所示,其中60℃,62℃和64℃有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生,66℃無條帶產(chǎn)生,陰性對(duì)照無條帶產(chǎn)生,因此LAMP引物擴(kuò)增溫度可選擇60℃,62℃,64℃中任一溫度。

    2.1.2時(shí)間優(yōu)化

    豬圓環(huán)病毒2型LAMP引物擴(kuò)增在60℃下擴(kuò)增不同時(shí)間的后核酸電泳檢測結(jié)果(見圖3)。其中擴(kuò)增45 min、60 min后均有擴(kuò)增條帶產(chǎn)生,30 min無條帶產(chǎn)生,因此可選擇LAMP反應(yīng) 60℃下的擴(kuò)增時(shí)間為45 min。

    2.2 LAMP靈敏度檢測實(shí)驗(yàn)

    豬圓環(huán)病毒2型LAMP引物擴(kuò)增不同濃度梯度基因后核酸電泳檢測結(jié)果,擴(kuò)增條件為60℃,擴(kuò)增時(shí)間為45 min。如圖所示:107~101個(gè)拷貝的模板均有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生,其余無條帶產(chǎn)生,圖4可看出本研究所設(shè)計(jì)的LAMP引物在60℃下,擴(kuò)增45 min之后最少可檢出10個(gè)拷貝的模板。

    2.3LAMP特異性檢測實(shí)驗(yàn)

    以豬圓環(huán)病毒2型基因組為模板,使用LAMP引物在60℃下擴(kuò)增45 min后核酸電泳檢測結(jié)果。由圖5可見,豬圓環(huán)病毒2型LAMP引物特異性擴(kuò)增出了豬圓環(huán)病毒2型基因片段,而與其他病原并無交叉反應(yīng)。

    2.4染料可視化試驗(yàn)

    向LAMP引物擴(kuò)增不同濃度梯度基因的反應(yīng)產(chǎn)物管內(nèi)加2 μl SYBR GreenⅠ熒光染料,肉眼觀察,陽性反應(yīng)管顏色立刻變?yōu)辄S綠色,且模板濃度不同顏色有深淺變化(圖6)。由此可見,LAMP 反應(yīng)結(jié)果容易判定,臨床推廣。

    3討論

    豬圓環(huán)病毒根據(jù)基因型和致病性可分為PCV-1和PCV-2兩種類型,PCV1沒有致病性。系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明,PCV-1和PCV-2屬于不同基因群,但其基因組仍存在較高的同源性[11],與病毒復(fù)制相關(guān)的DNA復(fù)制起始區(qū)(Ori)和復(fù)制酶編碼基因(Rep)序列同源性分別為79.5%和82%,衣殼蛋白編碼基因(Cap)存在較大差異,同源性僅為62%[12]。

    建立PCV-2的LAMP檢測方法,引物的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。PCV-2含有11個(gè)閱讀框,其中第一個(gè)和第二個(gè)為主要的閱讀框,各實(shí)驗(yàn)室目前基因疫苗的研制主要圍繞這兩段基因序列。第一個(gè)閱讀框編碼與復(fù)制相關(guān)的酶,第二個(gè)閱讀框PCV-2 Cap基因編碼該病毒衣殼蛋白,基因N端123個(gè)堿基為信號(hào)肽編碼序列,編碼的衣殼蛋白上有病毒的主要保護(hù)性抗原位點(diǎn),具有免疫原性,能引起機(jī)體產(chǎn)生抗體,故選取該基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。

    LAMP技術(shù)可以保證擴(kuò)增的高特異性和高效率,其依賴于能夠識(shí)別靶DNA 上6個(gè)特定區(qū)域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶,在恒溫條件下擴(kuò)增核酸,能從僅相差一個(gè)核苷酸的基因標(biāo)本中找出相應(yīng)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增,根據(jù)擴(kuò)增與否即可判斷目的基因是否存在。

    綜合文中的試驗(yàn)結(jié)果,LAMP 檢測技術(shù)為豬圓環(huán)病毒2型基因的診斷提供了一種快速、便捷且特異性強(qiáng)、敏感性高的檢測方法,可用于豬圓環(huán)病毒2型臨床檢測,并具有非常良好的應(yīng)用前景?!觯ň庉嫞汉畏迹?/p>

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