超聲波輔助提取庫爾勒香梨果肉和果皮中總黃酮的工藝研究

烏英 解云 古娜娜·對山別克 海力茜·陶爾大洪

摘要

[目的]研究庫爾勒香梨果肉和果皮中總黃酮的最佳提取工藝。[方法]以乙醇為溶劑，采用超聲波輔助提取，紫外-可見分光光度法測定庫爾勒香梨果肉和果皮中總黃酮的含量，以總黃酮含量為指標，考察提取溫度、料液比、醇濃度、提取次數對庫爾勒香梨果肉和果皮中總黃酮提出率的影響。對照品溶液和供試品溶液均在371 nm處有最大吸收，回歸方程為A=0.055 1C-0.007 5，r=0.999 8（0～16 μg/ml）。[結果]最終確定香梨果肉中總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度75%，提取時間2 h，提取溫度40 ℃，提取次數為1次；果皮中總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度85%，提取時間1.0 h，提取溫度40 ℃，提取次數為3次。庫爾勒香梨果肉和果皮中平均總黃酮得率分別為1.79和5.12 mg/g。[結論]通過穩(wěn)定性、精密度和回收率試驗檢驗了該方法的可靠性和重現性。

關鍵詞 庫爾勒香梨果肉和果皮；超聲提??；總黃酮

中圖分類號 S661.2 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）26-09148-02

Study on Extraction Technology of Total Flavonoid from Pyrus bretschneideri Rehd Peel and Pulp by Ultrasonic Assisted Extraction

WU Ying， HAILIXI Taoerdahong et al

（College of Pharmacy， Xinjang Medical University， Urumqi， Xinjiang 830011）

Abstract [Objective] To study the optimum extraction technique for total flavonoids from Pyrus bretschneideri Rehd fruit and peel. [Method] Ethanol as a solvent， using ultrasonic assisted extraction， UV-visible spectrophotometry was adopted to extract total flavonoids from fruit and peel of Pyrus bretschneideri Rehd. Effects of extraction temperature， solid-liquid ratio， ethanol concentration， extraction times on total flavonoids extraction yield were investigated. The reference solution and the test solution are maximum absorption at 371 nm. The regression equation is A=0.055 1C-0.007 5， r=0.999 8（0-16 μg/ml）. [Result] Eventually determine the optimum extraction conditions of total flavonoids in Pyrus bretschneideri Rehd pear flesh as follows： 75% ethanol concentration， extraction time 2 hours， extraction temperature 40 ℃， extraction times for 1 times. The best extraction conditions for total flavonoids in flesh： ethanol concentration 85%， 1.0 hours extraction time， extraction temperature 40 ℃， extraction times for 3 times. Pyrus bretschneideri Rehd in the pulp and peel， the average yield of flavonoid were 1.79 and 5.12 mg/g. [Conclusion] Through the stability， precision and recovery experiment examined the reliability and reproducibility of the method.

Key words Pyrus bretschneideri Rehd peel and pulp； Ultrasonic extraction； Total flavonoids

新疆庫爾勒香梨（Pyrus Bretschneideri Rehd ）為薔薇科梨屬中的白梨品種，其種植歷史已有1 400～2 000年^[1-2]，在新疆的種植面積廣、年產量高，果皮為黃綠色或略帶紅色，具有細嫩、多汁、甘甜、香味濃郁等特點，同時香梨富含果糖、蘋果酸、維生素、礦物質等營養(yǎng)成分。現代藥理研究表明，香梨具有抗氧化、抗?jié)?、抗炎、?zhèn)咳祛痰平喘、抑菌、抗癌等功效^[3]。

目前已分離出的黃酮類化合物總數超過4 000個，廣泛用于醫(yī)藥領域。黃酮類化合物可降低血管脆性及異常的通透性，可降血脂，降血壓，抑制血小板聚集及血栓的形成，有抗肝臟病毒、抗炎抗菌、抗癌防癌、抗氧化及抗衰老等作用^[4]。目前，對庫爾勒香梨的研究大多還停留在保鮮加工方面，還未見對庫爾勒香梨中黃酮物質的提取、純化、應用等的研究報道。筆者通過對超聲波輔助提取庫爾勒香梨中黃酮物質的工藝進行研究，確定提取溶劑與應用的濃度、提取時間等參數，為庫爾勒香梨資源的充分開發(fā)利用提供依據^[5-6]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對象。干燥、粉碎的新疆庫爾勒香梨的果皮和果肉。

1.1.2

儀器。UV9100D型紫外可見分光光度計，北京菜伯泰科儀器有限公司；BS224型電子分析天平，德國賽多利斯公司，SK5200HP超聲清洗器，上?？茖С晝x器有限公司；RE-52A旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器。

1.1.3

試劑。 蘆丁對照品（批號：100080-200707），中國藥品生物制品檢定所；乙醇（95%），天津市富宇精細化工有限公司，分析純；5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液、4%氫氧化鈉溶液，均采用分析純，現配現用；試驗用水為蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1

香梨黃酮標準曲線的制備。 黃酮的標準品為蘆丁，分別精密吸取蘆丁對照品溶液（0.08 mg/ml）0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml于25 ml容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液10.0 ml，再加入75%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，以不加對照品溶液的相應溶液為空白對照，在371 nm波長處測定吸光度，以對照品溶液濃度（C）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，得校準曲線A=0.055 1C-0.007 5，r=0.999 8，線性范圍在0～16 μg/ml，表明線性關系良好。

1.2.2

超聲波輔助提取總黃酮。 精密稱取1.0 g干燥的庫爾勒香梨果肉和果皮適當粉碎于錐形瓶中，以總黃酮含量為評價指標，分別考察不同提取溫度、不同含乙醇量、不同提取次數、不同提取時間在超聲波條件下對萃取庫爾勒香梨中總黃酮的影響。根據單因素試驗結果，選取主要影響因素及合適的水平進行正交試驗，確定香梨果肉和果皮中黃酮提取的最佳條件工藝條件。

1.2.3

測定液的制備。 準確移取香梨果肉供試品溶液5.0 ml、香梨果皮供試品溶液3.0 ml，于25 ml容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液1.0 ml，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10.0 ml，再加入60%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，得測定液備用。

1.2.4

最大吸收波長的選擇。 準確移取對照品溶液和供試品溶液，按“1.2.1標準曲線的制備”方法平行顯色，以試劑作為空白對照，在波長200～700 nm范圍內進行連續(xù)波長掃描。結果表明，對照品溶液及供試液均在371 nm處有最大吸收，故選擇371 nm處為測定波長。

1.2.5

樣品含量的測定。 根據單因素試驗結果取最佳提取條件，提取9份供試品溶液，按“1.2.1”項下依法測定各個溶液的吸光度，并根據回歸曲線方程計算總黃酮的濃度，推算出庫爾勒香梨果肉和果肉中總黃酮的含量。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1

乙醇濃度對提取效果的影響。 精密稱取干燥香梨果皮及果實各1.000 0 g，置于250 ml錐形瓶中，按提取時間為1 h，溫度60 ℃，提取次數為1次，乙醇濃度為40%、50%、65%、75%、85%、95%，進行超聲波輔助萃取，然后濃縮定容至50 ml容量瓶中，按“1.2.3”項下加入試劑顯色，最后定容至刻度，在371 nm 處測定吸收度，計算總黃酮含量。試驗得出，香梨果肉中總黃酮的含量隨著乙醇濃度的增加而有所提高，但當乙醇濃度>75%時，增加幅度很小。香梨果皮中總黃酮的含量當乙醇濃度>85%時，增加幅度較小，所以確定了3個最佳料液比來進行香梨黃酮提取的正交試驗。

2.1.2

提取時間對提取效果的影響。 精密稱取干燥香梨果皮及果實1.000 0 g，置于250 ml錐形瓶中，按料液比1∶20 g/ml加入75%乙醇，溫度60 ℃，提取次數為1次，分別按提取時間30、60、90、120、180 min進行回流，然后濃縮定容至50 ml容量瓶中，按“1.2.3”項下加入試劑顯色，最后定容至刻度，在371 nm 處測定吸收度，計算總黃酮含量。根據得到的香梨黃酮含量可得知，香梨果肉中總黃酮隨時間的增長提取量越高，超聲時間120 min后變化較??；香梨果皮中總黃酮提取量則在超聲時間90 min內可以得到較高水平。

2.1.3

提取溫度對提取效果的影響。 精密稱取干燥香梨果皮及果實1.000 0 g，置于250 ml錐形瓶中，按料液比1∶20 g/ml加入75%乙醇，提取次數為1次，分別按提取溫度20、40、60、80、100 ℃進行回流，然后濃縮定容至50 ml容量瓶中，按“1.2.3”項下加入試劑顯色，最后定容至刻度，在371 nm處測定吸收度，計算總黃酮含量。試驗得出，香梨果肉和果皮中總黃酮提取量在40 ℃時含量最高。

2.1.4

提取次數對提取效果的影響。 精密稱取干燥香梨果皮及果實1.000 0 g，置于250 ml錐形瓶中，按料液比1∶20 g/ml加入75%乙醇，提取溫度60 ℃，提取時間1 h，分別按提取次數為1、2、3、4、5次進行回流，然后濃縮定容至50 ml容量瓶中，按“1.2.3”項下加入試劑顯色，最后定容至刻度，在371 nm處測定吸收度，計算總黃酮含量。由試驗可知，總黃酮提取量隨著超聲次數的增加而提高，但超聲次數為3次時，總黃酮的提取量最高。

根據單因素試驗結果確定了庫爾勒香梨果肉及果皮進行正交試驗的最佳因素水平，見表1、2。

2.2 正交試驗結果

由表3可知，

各因素水平對香梨中果肉總黃酮的影響順序為乙醇濃度（A）>提取時間（D）>提取次數（C）>溫度（B），即A₃D₃C₁B₁。結合方差分析，可知A、B、C、D因素的P均小于0.05，有顯著差異，果肉中各因素對試驗的影響大小為：A>D>C>B，該結果與直觀分析的結果一致，所選條件成立：即乙醇濃度75%，提取時間2 h，提取溫度40 ℃，提取次數為1次。

0.05，有顯著差異，果皮中各因素對試驗的影響大小為：C>A>B>D，該結果與直觀分析的

結果一致，所選條件成立：乙醇濃度85%，提取時間1.0 h，提取溫度40 ℃，提取次數為3次。

2.3 提取工藝驗證

2.3.1

重現性試驗。 精密稱取3份干燥的庫爾勒香梨果肉和果皮，每份1.0 g，按最佳工藝提取，按“1.2.3”項下顯色處理后于371 nm波長處測定吸光度， 求得果肉的RSD=0.02%（n=6），果皮的RSD=0.3%，表明所選工藝合理可行。

2.3.2

精密度試驗。 精密稱取6份干燥的庫爾勒香梨果肉和果皮，每份1.0 g，按最佳工藝提取，按“1.2.3”項下顯色處理后于371 nm波長處測定吸光度。求得果肉RSD=0.8%（n=6），果皮的RSD=0.45%，表明儀器精密度良好。

2.3.3

加樣回收率試驗。 精密稱取1.0 g 6份庫爾勒香梨果肉和果皮至250 ml錐形瓶中，經提取顯色處理濃縮后放置50 ml容量瓶，按低、中、高濃度分別加入蘆丁對照品1 ml（80 μg），2 ml（160 μg），3 ml（240 μg），稀釋至刻度。于371 nm波長處測定吸光度。結果表明，果肉平均回收率為100.12%，RSD=1.3%（n=6），果皮平均回收率為98.5%，RSD=0.8%（n=6）。

2.3.4

穩(wěn)定性試驗。 取供試品2 ml至25 ml容量瓶中按“1.2.3”項下顯色處理，分別于0、5、10、15、20、25、30 min測定吸光度，表明其顯色后30 min中基本穩(wěn)定，求得果肉RSD值為0.3%（n=6），果皮RSD值=0.5%（n=6），表明穩(wěn)定性良好。

3 討論

該試驗采用超聲波輔助提取庫爾勒香梨中的總黃酮，考察了超聲波對庫爾勒香梨果肉和果皮中總黃酮提取效果的影響。結果表明，超聲波對庫爾勒香梨果肉和果皮中總黃酮的提取過程影響明顯，且通過單因素和正交試驗確定了影響庫爾勒香梨果肉中總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度75%，提取時間2 h，提取溫度40 ℃，提取次數為1次。果皮中總黃酮的最佳提取條件為：乙醇濃度85%，提取時間1 h，提取溫度40 ℃，提取次數為3次。庫爾勒香梨果肉和果皮中平均總黃酮得率分別為1.79和5.12 mg/g，該研究為開發(fā)和利用香梨有效部位提供了理論依據。

參考文獻

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