NO對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒的影響研究

張永帥,王淼焱,孫俊良,梁新紅,張婷

（河南科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003）

NO對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒的影響研究

張永帥,王淼焱,孫俊良,梁新紅,張婷

（河南科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003）

研究了不同濃度NO供體SNP和NO清除劑cPTIO對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒的影響.結(jié)果表明：在黃曲霉培養(yǎng)過程中添加SNP能導(dǎo)致黃曲霉菌體內(nèi)NO量增多,產(chǎn)毒量減少；當(dāng)添加NO清除劑cPTIO時(shí)黃曲霉菌體內(nèi)NO量降低,產(chǎn)毒量增加.SNP濃度為0.200 mmol/L時(shí),黃曲霉產(chǎn)黃曲霉毒素的量為0.87 μg/mL,比不添加時(shí)降低了16.35 μg/mL,而且添加SNP的黃曲霉菌體NO熒光值明顯增高.說明NO對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒有一定的抑制作用.

黃曲霉；黃曲霉毒素；NO；抑制作用

黃曲霉毒素（aflatoxin）,也稱作黃曲霉素,是一種有強(qiáng)烈生物毒性的化合物,常由黃曲霉及另外幾種霉菌在霉變的谷物中產(chǎn)生,如大米、豆類、花生等,是迄今為止所知最強(qiáng)的致癌物質(zhì)之一[1-4].黃曲霉毒素主要有B1、B2、G1與G2等4種,又以B1的毒性最強(qiáng).食米儲(chǔ)存不當(dāng),極易發(fā)霉變黃,產(chǎn)生黃曲霉毒素.黃曲霉毒素與肝癌有密切關(guān)系,還會(huì)引起組織失血、厭食等癥狀[5].1960年在英國(guó)發(fā)生了因喂食黃曲霉毒素花生粕而導(dǎo)致大批火雞暴斃事件.警惕黃曲霉毒素的危害,要注意剔除霉變的食物顆粒,還可采用以水淘洗的辦法進(jìn)一步凈化易沾染的食物中的霉菌.當(dāng)然,用高溫?zé)⒄ㄖ?80℃以上也可以達(dá)到分解毒素和去除污染的效果.黃曲霉是產(chǎn)生黃曲霉毒素的主要菌種之一,因而,研究調(diào)控黃曲霉產(chǎn)毒機(jī)理成為當(dāng)今熱點(diǎn)[6].

人們一直在致力尋找防治黃曲霉的方法,特別是2011年國(guó)家質(zhì)檢總局查出蒙牛產(chǎn)品黃曲霉毒素M超標(biāo),迫使我們亟需尋求一個(gè)能夠有效控制黃曲霉污染的方法.自20世紀(jì)70年代以來,很多學(xué)者嘗試通過改良栽培技術(shù)、使用化學(xué)藥劑和生物控制等方法來克服這一棘手問題[7-9].NO作為人體內(nèi)的信使分子,它不需要任何中介機(jī)制就可快速擴(kuò)散通過生物膜,將一個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的信息傳遞到它周圍的細(xì)胞中,主要影響因素是它的生物半衰期.具有多種生物功能的原因在于它是自由基,極易參與傳遞電子反應(yīng),加入機(jī)體的氧化還原過程中.分子的配位性又使它與血紅素鐵和非血紅素鐵具有很高的親合力,以取代O2和CO2的位置.據(jù)研究報(bào)道,血紅蛋白-NO可以失去它附近的堿基而變成自由的原血紅素-NO,這就意味著自由的堿基可以自由地參與催化反應(yīng),自由的蛋白質(zhì)可以自由地改變構(gòu)象,自由的血紅素可以自由地從蛋白中擴(kuò)散出去,這三種變化中的任何一個(gè)或它們的組合,將在鳥苷酸環(huán)化酶的活化過程中起重要作用.NO的生物學(xué)作用和其作用機(jī)制研究方興未艾,它的發(fā)現(xiàn)提示著無機(jī)分子在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中研究的前景.

有些報(bào)道還提出NO參與植物的調(diào)節(jié)[10],那么NO是否參加黃曲霉產(chǎn)毒的調(diào)控呢？這個(gè)問題至今還未見報(bào)道.本研究通過使用NO的供體SPN、NO清除劑cPTIO、NO熒光探針等方法來研究NO對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒的影響.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃曲霉模式菌株,購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種管理保藏中心；黃曲霉毒素B1（aflatoxinB1AFB1）,由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院贈(zèng)送；乙腈、甲醇、AFB1標(biāo)準(zhǔn)品為色譜純,其余試劑均為分析純.

VariosKan Flash（美國(guó)Thermo公司）；2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；BM-38XBV熒光顯微鏡（日本尼康公司）；SW-CJ-1D單人單面垂直送風(fēng)（經(jīng)濟(jì)型）凈化工作臺(tái)（中國(guó)蘇州智凈凈化有限公司）；MTN-2800W氮吹儀（天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；Heidolph VV2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph公司）；ZHWI-Z11C恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司）；SHP型生化培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海中安醫(yī)療器械廠）.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸浮液制備 取保存的黃曲霉菌接種于PDA平板上,30℃下培養(yǎng)4 d,待黃曲霉長(zhǎng)滿平板后,將無菌Tritonx-100（0.1%）5 mL注入平板,輕搖使黃曲霉孢子均勻分散,取懸液用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù),稀釋成1×106CFU/mL待用,黃曲霉孢子要現(xiàn)制現(xiàn)用[11].

1.2.2 不同濃度SNP下黃曲霉產(chǎn)毒量的測(cè)定 在滅好菌的沙氏培養(yǎng)基中添加不同濃度的SNP,使其最終濃度分別為0.150、0.175、0.200、0.225、0.250、0.275、0.300、0.400、0.600、0.800、1.000和1.200 mmol/L,將制備好的孢子懸浮液接種于沙氏培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)48 h,待測(cè).

1.2.3 不同濃度NO清除劑cPTIO 下黃曲霉產(chǎn)毒量的測(cè)定在滅好菌的沙氏培養(yǎng)基中添加不同濃度的cPTIO,使其最終濃度分別為0.100、0.150和0.200 mmol/L,將制備好的孢子懸浮液接種于沙氏培養(yǎng)基中, 30℃培養(yǎng)48 h,待測(cè).

1.2.4 AFB1提取及含量測(cè)定 吸取一定量提取液,加3倍氯仿萃取,萃取液于60℃用氮吹儀吹干,溶解在甲醇中,過0.22 m微孔濾膜,然后用HPLC測(cè)定.色譜柱：COSMOSIL 5C18-MS-ⅠⅠPacked Column（4.6 mmI.D.×250 mm）（上海泉島公司）；柱溫：22℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm；流動(dòng)相：V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（水）=1∶1∶2；流速：1 mL/min[12].

1.2.5 NO熒光值的測(cè)定 在3瓶滅好菌的沙氏培養(yǎng)基中分別添加等量的無菌水、SNP、cPTIO,使其SNP和cPTIO最終濃度分別為0.250、0.100 mmol/L,將制備好的孢子懸浮液接種于沙氏培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)48 h,分別取3種菌液1 mL放入1.5 mL離心管中,每管添加5 μL DAF-FM溶液,混勻,取2 μL混合液滴到載玻片上,蓋上蓋玻片在熒光顯微鏡上觀察拍照.另外分別取200 μL混合液放入96孔板A01-A03用VariosKan Flash在激發(fā)波長(zhǎng)495 nm,發(fā)射波長(zhǎng)515 nm下測(cè)熒光值.

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù)3次,AFB1產(chǎn)量平均值利用SPSS軟件平臺(tái)中SNK法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 SNP對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒的影響

SPN添加量對(duì)黃曲霉毒素抑制率的影響見圖1.SNP添加量對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒量的影響見圖2.

圖1 SNP對(duì)黃曲霉毒素抑制率的影響Fig.1 The effect of SNP on aflatoxin inhibition rate

圖2 SNP對(duì)黃曲霉毒素產(chǎn)量的影響Fig.2 The effect of SNP on aflatoxin production

由圖1可知,當(dāng)SNP添加濃度為0.200 mmol/L時(shí)對(duì)黃曲霉產(chǎn)黃曲霉毒素的抑制率為64%,SNP添加濃度≥0.4 mmol/L時(shí)對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒的抑制率均為100%.由圖2可知,不加SNP的黃曲霉產(chǎn)毒量為17.28 μg/mL,SNP添加濃度為0.150、0.175、0.200、0.225、0.250、0.275和0.300 mmol/L時(shí)黃曲霉的產(chǎn)毒量分別為7.80、11.53、0.87、2.79、4.98、6.73和10.22 μg/mL,與對(duì)照相比添加SNP的黃曲霉產(chǎn)毒量都有所下降,SNP濃度為0.200 mmol/L時(shí)黃曲霉產(chǎn)毒量最小為0.87 μg/mL,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照的產(chǎn)毒量,說明SNP確實(shí)參與了黃曲霉產(chǎn)毒的調(diào)控.

2.2 NO清除劑cPTIO對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒的影響

NO清除劑cPTIO添加量對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒的影響見圖3.

圖3 NO清除劑cPTIO對(duì)黃曲霉產(chǎn)毒的影響Fig.3 The effect of NO scavenger cPTIO on aflatoxin toxin-producing

由圖3可知,添加NO清除劑cPTIO的濃度為0.100、0.150和0.200 mmol/L時(shí)黃曲霉產(chǎn)毒素的量分別為20.56、21.74和21.73 μg/mL,不添加NO清除劑cPTIO（對(duì)照）的黃曲霉產(chǎn)毒素的量為17.22 μg/mL.添加NO清除劑cPTIO后黃曲霉產(chǎn)毒素量增加,說明NO參與調(diào)控黃曲霉產(chǎn)毒.

2.3 不同處理下黃曲霉菌體內(nèi)NO熒光值的變化

3種處理下黃曲霉菌體內(nèi)NO熒光強(qiáng)度的變化見圖4.

圖4 不同處理下黃曲霉菌體內(nèi)NO的熒光強(qiáng)度Fig.4 The fluorescence intensity of NO in Aspergillus flavus under different treatments

由圖4可知,添加SNP的濃度為0.250 mmol/L時(shí)黃曲霉菌體在熒光顯微鏡下可以看到明顯的熒光；對(duì)照黃曲霉菌體在熒光顯微鏡下可以看到微弱的熒光值；而添加NO清除劑cPTIO的黃曲霉菌體在熒光顯微鏡下沒有看到熒光.

3種處理下黃曲霉熒光值的變化見圖5.

圖5 不同處理下黃曲霉的熒光值Fig.5 The aflatoxin fluorescence value under different treatments

由圖5可知,添加SNP的濃度為0.250 mmol/L時(shí)黃曲霉菌體用VariosKan Flash在激發(fā)波長(zhǎng)495 nm.發(fā)射波長(zhǎng)515 nm下測(cè)得DAF-FM熒光值為66.87；對(duì)照黃曲霉菌體測(cè)得DAF-FM熒光值為24.1；而添加NO清除劑cPTIO的黃曲霉菌體熒光值為0.

3 結(jié)論

在黃曲霉培養(yǎng)過程中添加SNP能導(dǎo)致黃曲霉菌體NO量增強(qiáng),導(dǎo)致黃曲霉產(chǎn)毒量減少；當(dāng)添加NO清除劑cPTIO時(shí)黃曲霉菌體NO量減弱,導(dǎo)致黃曲霉產(chǎn)毒量增加；當(dāng)SNP添加量在0.200 mmol/L時(shí),黃曲霉產(chǎn)毒素的量為0.87 μg/mL,比不添加時(shí)降低了16.35 μg/mL.說明NO抑制黃曲霉產(chǎn)生毒素,其機(jī)理還需要進(jìn)一步研究.

[1] 計(jì)成,趙麗紅,馬秋剛,等.黃曲霉毒素生物降解的研究及前景展望[J].中國(guó)家禽,2009,31（21）：6-9.

[2] 許艷麗,鮑蕾,梁成珠,等.黃曲霉毒素檢測(cè)及其生物防治方法的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35（32）：10210-10212,10228.

[3] Wu F.Mycotoxin risk assessment for the purpose of setting inter-national regulatory standards[J].Environmental Science& Technology,2004,38（15）：4049-4055.

[4] 計(jì)成,趙麗紅.黃曲霉毒素生物降解的研究及前景展望[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2010,22（2）：241-245.

[5] 劉濱磊,劉興玢.四種ELISA方法檢測(cè)食品中黃曲霉毒素B1的對(duì)比研究[J].衛(wèi)生研究,1990,19（6）：25-27.

[6] Nogueira J H C,Goncalez E,Galleti S R,et a1.Ageratumconyzoidesessential oil as aflatoxin suppressor ofAspergillus flavus[J]. International Joumal of Food Microbiology,2010,137（1）：55-60.

[7] 劉羅發(fā),黃德娟,黃德超,等.食品中黃曲霉毒素及理化脫毒措施研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39（8）：4756-4757,4759.

[8] 安虹,鄒廣迅.黃曲霉素毒性效應(yīng)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39（24）：15007-15009,15012.

[9] Lay F T,Bmgliera F,Anderson MA.Isolation and pmpeies of floral defensins fromor namental tobacco and petunia[J].Plant Physiol,2003,131（2）：1283-1293.

[10] 朱麗琴,朱樹華,周杰.NO延緩園藝產(chǎn)品成熟和衰老的生理效應(yīng)研究進(jìn)展[J].園藝學(xué)報(bào),2008,35（10）：1539-1544.

[11] 章挺.枯草芽孢桿菌B-FS06對(duì)黃曲霉的抑制及活性物質(zhì)研究[D].南京：南京師范大學(xué),2007.

[12] Moyne A L,Cleveland T E,Tuzun S.Molecular characterization and analysis of the operon encoding the antifungal lipopeptide bacillomycin D[J].FEMS Microbiology Letters,2004,234（1）：43-49.

（責(zé)任編輯：鄧天福）

Effect of NO on aftatoxin production of Aspergillus flavus

Zhang Yongshuai,Wang Miaoyan,Sun Junliang,Liang Xinhong,Zhang Ting
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

The effects of different concentrations of NO donor SNP andNO scavenger cPTIO on aflatoxin production ofA spergillus flavuswas weinvestigated in this study.The results showed that：SNP is added in the process ofA.flavustraining can lead to NO increase in the number of quantity,reduce the amount of aflatoxin toxinproducing,A.flavusNO amount reduced and leading toA.flavustoxin-producing quantity increase when adding NO scavenger cPTIO,A spergillus flavusproducing aflatoxin is 0.87 μg/mL,lower than when no added（including 16.35μg/mL）and add the SNPA.flavusNO fluorescence value is significantly increased when the amount of addition of SNP is 0.200 mmol.NO toA.flavustoxin-producing has certain inhibitory effect.

Aspergillus flavus；aflatoxin；NO；inhibition

TS201.3

A

1008-7516（2014）03-0026-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2014.03.006

2014-05-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（311641/C200101）；河南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（122102110037）

張永帥（1987-）,男,河南許昌人,碩士研究生.主要從事食品生物技術(shù)研究.

孫俊良（1964-）,男,河南新鄉(xiāng)人,博士,教授,碩士生導(dǎo)師.主要從事食品生物技術(shù)與酶制劑工程研究.