升血顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

戴曉雁，王玉潔，魏學(xué)兵

1 甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅省藥品檢驗(yàn)所

升血顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

戴曉雁1，王玉潔1，魏學(xué)兵2

1 甘肅省腫瘤醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2 甘肅省藥品檢驗(yàn)所

目的：建立升血顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜（TLC）法對(duì)升血顆粒中山茱萸、黃芪、丹參、麥門冬進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法對(duì)升血顆粒中馬錢苷的含量進(jìn)行定量測定。結(jié)果：TLC斑點(diǎn)清晰、分離度好，陰性對(duì)照無干擾；馬錢苷進(jìn)樣量在0.0752～0.451μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系（r＝0.9983），平均加樣回收率為96.2％，RSD＝2.3％（n＝6）。結(jié)論：所建立的標(biāo)準(zhǔn)可用于升血顆粒的質(zhì)量控制。

升血顆粒；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法

升血顆粒是甘肅省腫瘤醫(yī)院院內(nèi)制劑（甘藥制字Z04410885），由山茱萸、黃芪、丹參、麥門冬等20余味中藥組成，具有健脾益腎，益氣生血，升高白細(xì)胞、血小板及補(bǔ)血作用，可明顯減輕放、化療的毒副反應(yīng)，減緩放、化療血象下降，增強(qiáng)機(jī)體免疫力［1-6］。本研究對(duì)處方中山茱萸、黃芪、丹參、麥門冬進(jìn)行薄層色譜（TLC）鑒別，并對(duì)方中主藥山茱萸有效成分馬錢苷的含量采用高效液相色譜（HPLC）法進(jìn)行測定，建立制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期有效控制制劑質(zhì)量，從而達(dá)到確保臨床療效的目的。

1 材料

1.1 儀器與試藥 Waters 515液相色譜儀（美國Waters公司）；AE260型萬分之一電子天平（瑞士Mett1e公司）；CP225D型十萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯公司）；超聲波清洗儀［必能信超聲（上海）有限公司］；快速開蓋萬能高速粉碎機(jī)（上海市晟喜制藥機(jī)械有限公司）；硅膠G板（青島海洋化工廠分廠）；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。熊果酸對(duì)照品（批號(hào)：110742-200516）；馬錢苷對(duì)照品（批號(hào)：110726-200521），黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)110781-200512），丹參對(duì)照藥材（批號(hào)：120923-200408），麥門冬對(duì)照藥材（批號(hào)：121013-200607）均購自中國藥品生物制品檢定所。升血顆粒（批號(hào)：20090423、20090425、20090524）、陰性對(duì)照品（批號(hào)：20090528）由甘肅省腫瘤醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜（TLC）鑒別

2.1.1 山茱萸薄層色譜（TLC）鑒別 取本品6g，加乙醇25mL，加熱回流1小時(shí)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)檬兔眩?0～90℃）浸泡2次，15mL/次，傾去石油醚液，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為供試品溶液。取不含山茱萸的陰性樣品6g，按上述方法制備陰性對(duì)照溶液。另取熊果酸對(duì)照品，加乙醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版附錄VIB），吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷∶三氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲酸（20∶5∶8∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365nm）下檢視［7］。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同斑點(diǎn)；陰性對(duì)照無相應(yīng)斑點(diǎn)，結(jié)果見圖1-A。

2.1.2 黃芪薄層色譜（TLC）鑒別 取本品6g，研細(xì)，置三角燒瓶中，加甲醇超聲提取3次（25、30、30mL），15min/次，過濾，合并濾液，蒸干，殘?jiān)?0mL水溶解，置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取4次（25，25，20，20mL），合并正丁醇液，用氨試液提取3次（20，20，20mL），棄去氨液，正丁醇蒸干，用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取不含黃芪的陰性樣品6g，按上述方法制備陰性對(duì)照溶液。取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。按照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版附錄VIB），吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿∶甲醇∶水（30∶10∶1）［8］為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在105℃烘烤約5分鐘，至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示，供試品色譜中在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同棕色斑點(diǎn)，陰性樣品無相應(yīng)斑點(diǎn)，結(jié)果見圖1-B。

2.1.3 丹參薄層色譜（TLC）鑒別 取本品6g，加水50mL使溶解，加熱煮沸15分鐘，過濾，濾液用鹽酸調(diào)pH2～3，加乙酸乙酯萃取2次，10mL/次，合并乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴?mL使溶解，作為供試品溶液。取不含丹參的陰性樣品6g，按上述方法制備陰性對(duì)照溶液。取丹參對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版附錄VIB），吸取上述3種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸（80∶50∶8）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2％三氯化鐵乙醇溶液，105℃烘至斑點(diǎn)顯色清晰［9］。結(jié)果顯示，供試品色譜中在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無相應(yīng)斑點(diǎn)，結(jié)果見圖1-C。

2.1.4 麥門冬薄層色譜（TLC）鑒別 取本品6g，研細(xì)，加甲醇30mL，超聲處理（功率120W，頻率40KHz）30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL、鹽酸1mL，加熱煮沸5分鐘，放冷。用乙醚振搖提取3次，30mL/次，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為供試品溶液。取不含麥門冬的陰性樣品6g，按上述方法制備陰性對(duì)照溶液。取麥門冬對(duì)照藥材2g，加水，煎煮10分鐘，濾過，濾液加鹽酸1mL同法制成對(duì)照藥材溶液。按照薄層色譜法（《中國藥典》2005年版附錄VIB），吸取上述3種溶液各10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（3∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰［10］。結(jié)果顯示，供試品色譜中在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無相應(yīng)斑點(diǎn)，結(jié)果見圖1-D。

圖1 升血顆粒中山茱萸、黃芪、丹參、麥門冬的薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 馬錢苷的含量測定

2.2.1.1 色譜條件 色譜柱：Luna C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：［四氫呋喃∶乙腈∶甲醇（1∶8∶4）］-0.05％磷酸溶液（10∶90），流速：1.0 1mL/min，進(jìn)樣量：10μL，檢測波長：236nm，柱溫：40℃，理論板數(shù)不得低于4000。

2.2.1.2 溶液的制備 精密稱取本品6g，研細(xì)，加在40％甲醇預(yù)洗的中性氧化鋁柱（100～200目，4g，內(nèi)徑1.5cm）上，用40％甲醇50mL洗脫，收集流出液及洗脫液，蒸干，殘?jiān)?0％甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加50％甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。陰性對(duì)照溶液的制備：按處方比例及制備工藝，制備不含山茱萸的陰性對(duì)照品，并按照“2.1.1”項(xiàng)制成陰性對(duì)照溶液。對(duì)照品溶液的制備：取馬錢苷對(duì)照品適量，加50％乙醇制成每1mL含20μg的溶液，即得［11］。

2.2.1.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 吸取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液及對(duì)照品溶液各10μL，按上述色譜條件進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示供試品中馬錢苷峰與對(duì)照品峰保留時(shí)間一致，并與樣品中其他組分達(dá)到很好分離，陰性對(duì)照品溶液中未出現(xiàn)相對(duì)應(yīng)的峰，見圖2。

圖2 升血顆粒中馬錢苷HPLC色譜圖

2.2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取馬錢苷對(duì)照品溶液（濃度15.04μg/mL）5、10、15、20，25，30μL進(jìn)樣，依“2.2.1.1”項(xiàng)色譜條件測定，以馬錢苷峰面積為縱坐標(biāo)，馬錢苷對(duì)照品的量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程C=9.0980×10-7A-3.4701×10-3，r=0.998 1。結(jié)果表明，馬錢苷在0.075 2～0.451 2μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.1.5 精密度 精密吸取馬錢苷對(duì)照品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定馬錢苷峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，測得馬錢苷峰面積RDS為1.18％。

2.2.1.6 重復(fù)性 按“2.2.1”項(xiàng)供試品溶液的制備方法及色譜條件，重復(fù)測定同一樣品6次，馬錢苷含量平均值為0.146mg/g，RSD為2.3％。結(jié)果表明本方法重現(xiàn)性好。

2.2.1.7 穩(wěn)定性 精密吸取供試品溶液10μL，按“2.2.1.1”項(xiàng)色譜條件，于0，2，4，6，8，12，18小時(shí)進(jìn)樣，測定馬錢苷峰面積，RSD為2.5％。結(jié)果表明，供試品溶液在18小時(shí)內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

2.2.1.8 回收率試驗(yàn) 精密稱取本品3g，共取6份，分別精密加入馬錢苷對(duì)照品溶液（濃度為0.158mg/mL）1mL，按“2.2.1.1”項(xiàng)方法制備，進(jìn)樣10μL，測定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果馬錢苷平均加樣回收率為96.2％，RSD為2.3％，見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.9 含量限度的確定 為確定升血顆粒中馬錢苷的含量限度，對(duì)3批次升血顆粒進(jìn)行了馬錢苷含量測定。結(jié)果3批樣品（20090423、20090425、20090524）中馬錢苷含量分別為0.124、0.118、0.120mg/g。

3 討論

本制劑采用薄層色譜法對(duì)方中主藥山茱萸、黃芪、黨參和麥門冬進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜法對(duì)山茱萸所含主要成分馬錢苷進(jìn)行含量測定，能夠?qū)Ψ街懈髦魉庍M(jìn)行質(zhì)量控制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法操作簡便、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、陰性無干擾，所建立的標(biāo)準(zhǔn)可有效控制該制劑的質(zhì)量。

TLC鑒別實(shí)驗(yàn)中，對(duì)供試品溶液的制備方法、展開系統(tǒng)、顯色劑、硅膠板均做了大量的考察和比較，各供試品色譜圖與對(duì)照藥材、對(duì)照品色譜圖相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，供試品各斑點(diǎn)分離清晰，層析效果好，可以達(dá)到鑒別的目的。

采用HPLC法測定山茱萸中馬錢苷的含量，供試品組分多，成分復(fù)雜，故在供試品溶液的制備過程中，直接將研細(xì)的樣品粉末加在40％甲醇預(yù)洗的中性氧化鋁柱（100～200目，4g，內(nèi)徑1.5cm）上，用40％甲醇50mL洗脫，收集流出液及洗脫液后作為供試品溶液，基本剔除了其他成分的干擾。使得樣品中馬錢苷峰形好，與雜質(zhì)峰分離度高，并且有效除去了馬錢苷峰后雜質(zhì)，使得色譜峰重現(xiàn)性好。

本實(shí)驗(yàn)還比較了以甲醇-水［12］，乙腈-水［13］以及［四氫呋喃∶乙腈∶甲醇（1∶8∶4）］-0.05％磷酸溶液的不同比例作為流動(dòng)相，結(jié)果采用［四氫呋喃∶乙腈∶甲醇（1∶8∶4）］-0.05％磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相時(shí)馬錢苷能得到較好的分離；供試溶液中待測組分與相鄰組分分離度好，陰性對(duì)照無干擾。

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Study on Quality Standard of ShengXue Granules

DAI Xiaoyan1，WANG Yujie1，WEI Xuebing2
1 Gansu Provincial Cancer Hospital，Lanzhou 730050，China；2 Gansu Provincial Institute for Drug Control

Objective：To establish quality control of ShengXue granules.Methods：ShanZhuYu（Cornus officinalis），HuangQi（radix Astragalus），DanShen（radix salviae miltiorrhizae）and MaiMenDong［Ophitopogin japonicum（L.f）Ker.-Gawl.］in ShengXue granules were identified by TLC；the contents of loganin were determined by HPLC.Results：TCL figures were distinct and reproducible，the blank test showed no interference；loganin showed better linear relationship in the range between 0.0752 and 0.451 μg/mL and peak areas（r=0.998 3），average recovery rate was 96.2％，RSD=2.3％（n=6）.Conclusion：The standard could be used in quality control of ShengXue granules.

ShengXue granules；quality control；TLC；HPLC

R282.5

A

1004-6852（2014）01-0031-04

2013-06-27

戴曉雁（1978—），女，主管中藥師。研究方向：中藥制劑。