CYP2C19功能缺失性等位基因與老年冠心病患者支架植入術(shù)后氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性和療效的藥物基因組學(xué)研究

彭 利，張藍(lán)寧，陳 曦，王緒云，李曉琪，傅義程，楊 潔，張玉霄，陳韻岱，盧才義，尹 彤

(解放軍總醫(yī)院心血管內(nèi)科，100853 北京)

經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)是目前治療冠心病的主要手段，臨床指南推薦，PCI術(shù)后患者在服用阿司匹林的基礎(chǔ)上聯(lián)用氯吡格雷(Clopidogrel)12個(gè)月，可以降低心血管事件發(fā)生率[1]。近期氯吡格雷藥物基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，除臨床環(huán)境因素外，氯吡格雷代謝通路上的關(guān)鍵酶CYP2C19(cytochrome 2C19 gene)功能缺失性(loss-of-function，LOF)等位基因的變異型與氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性的降低和抗栓治療后臨床心血管終點(diǎn)事件的增加相關(guān)聯(lián)[2?4]。由于老年冠心病患者存在基礎(chǔ)疾病復(fù)雜、藥物代謝能力降低等情況，氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性較非老年人群顯著降低[5]。在此背景下，藥物基因組學(xué)因素是否在老年冠心病患者氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性的個(gè)體差異中發(fā)揮作用尚不清楚。鑒于此，本研究旨在探討CYP2C19 LOF等位基因與老年冠心病患者PCI術(shù)后氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性和心血管終點(diǎn)事件的關(guān)聯(lián)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究連續(xù)募集2011年9月1日至2012年12月1日在中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院接受冠狀動(dòng)脈支架植入治療并服用負(fù)荷劑量氯吡格雷的老年冠心病患者共436例。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥65歲；(2)按照最新美國(guó)心臟聯(lián)合會(huì)(American Heart Association，AHA)/美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)(American College of Cardiology，ACC)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]診斷為冠心病者；(3)需要長(zhǎng)期服用氯吡格雷者；(4)志愿參加，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)2周內(nèi)服用過(guò)氯吡格雷或噻氯匹定(ticlopidine)者；(2)對(duì)阿司匹林或氯吡格雷過(guò)敏、不能耐受或有抗血小板治療禁忌證者；(3)有慢性炎癥性疾病者或服用甾體、非甾體抗炎藥者；(4)近1個(gè)月內(nèi)有活動(dòng)性出血、出血體質(zhì)、有出血傾向或近期接受大手術(shù)者；(5)合并其他終末期疾病者。

1.2 采血時(shí)機(jī)和血小板聚集率的測(cè)定

擬行PCI術(shù)的老年冠心病患者，PCI術(shù)前服用負(fù)荷劑量氯吡格雷(300mg)，手術(shù)當(dāng)天采集外周靜脈血5ml，在20μmol/L ADP誘導(dǎo)下采用光密度比濁法測(cè)定血小板聚集率。同時(shí)留取依地酸(乙二胺四乙酸，edetic acid，EDTA)抗凝血5ml，-20℃保存，以備DNA提取和相關(guān)藥物代謝基因分型。

1.3 DNA提取和基因分型

采用百泰克中量全血DNA提取試劑盒(北京百泰克生物有限公司)提取DNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肧NaPshot法檢測(cè)候選SNPs位點(diǎn)，根據(jù)dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)提供的基因組序列設(shè)計(jì)引物和探針，SNPs檢測(cè)由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司完成。研究組通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)、Hapmap等權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)以及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道確定檢測(cè)以下2個(gè)候選基因位點(diǎn)：CYP2C19*2(rs4244258)、CYP2C19*3(rs4986893)。

1.4 研究終點(diǎn)及隨訪

研究療效終點(diǎn)事件包括：聯(lián)合心血管事件、主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACE)、全因死亡、支架內(nèi)血栓、因心絞痛再入院、主要出血事件和次要出血事件。MACE事件包括心源性死亡、非致死性心肌梗死、非致死性卒中及緊急靶血管血運(yùn)重建。隨訪時(shí)間為1年，由專人負(fù)責(zé)，詳細(xì)記錄患者心血管終點(diǎn)事件發(fā)生癥狀、次數(shù)等，統(tǒng)一填寫(xiě)隨訪表格。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0軟件包和Prism5.0制圖軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組資料比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分率表示，二分類或多分類資料采用χ2檢驗(yàn)。采用多元線性回歸或多元逐步回歸模型進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

符合入選標(biāo)準(zhǔn)患者的臨床信息、各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)及相關(guān)藥物治療等情況見(jiàn)表1。共納入436例，男280例(64.2%)，女156例(35.8%)，年齡65～92(73.0±5.7)歲。

2.2 基因型頻率及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

本研究采用SNaPshot法檢測(cè)2個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別是CYP2C19*2(rs4244285)和CYP2C19*3(rs4986893)。在436名患者中，CYP2C19*2攜帶者共215名(49.30%)，其中CYP2C19*2/*1攜帶者178名(40.80%)；CYP2C19*3攜帶者共48名(11.00%)，至少1個(gè)CYP2C19 LOF(CYP2C19*2或*3)攜帶者共263名(60.30%)。本研究檢測(cè)的2個(gè)基因型符合HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)(www.hapmap.com)中中國(guó)漢族人群相關(guān)基因型的分布規(guī)律，兩種變異類型均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05；表2)。

表1 患者臨床特征Table 1 Characteristics of the study population(n＝436)

2.3 不同基因型攜帶者氯吡格雷的抗血小板反應(yīng)性和療效的相關(guān)性分析

根據(jù)攜帶基因變異類型分類，首先比較不同基因型攜帶者與非攜帶者之間的氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性(圖1)。與野生型CYP2C19*1/*1攜帶者相比，CYP2C19*2攜帶者的血小板聚集率明顯升高[(46.17±20.99)%vs(35.60±18.72)%，P＝0.001]，同樣，至少1個(gè)CYP2C19 LOF等位基因攜帶者的血小板聚集率明顯高于非攜帶者[(45.97±20.92)%vs(35.71±18.27)%，P＝0.004]。而CYP2C19*3攜帶者與非攜帶者之間未見(jiàn)上述差異(P＝0.884)。心血管終點(diǎn)事件的單因素分析發(fā)現(xiàn)，CYP2C19*2攜帶者心血管終點(diǎn)事件的發(fā)生率較非攜帶者均明顯增加：包括MACE事件、因心絞痛再入院的發(fā)生率均明顯增加(P＜0.001，P＝0.007；表3)；CYP2C19 LOF攜帶者的聯(lián)合心血管終點(diǎn)事件、因心絞痛再入院、全因死亡發(fā)生率均明顯增加(P＝0.047，P＜0.001，P＜0.001；表3)。此外，經(jīng)多元逐步回歸分析發(fā)現(xiàn)，與非攜帶者相比，CYP2C19*2攜帶者因心絞痛再入院率[校正比值比(adds ratio，OR)：1.67，95%可信區(qū)間(confidence interval，CI)：1.05～2.65，P＝0.010；表3]明顯增加。至少1個(gè)CYP2C19 LOF攜帶者的聯(lián)合心血管事件(校正OR：1.22，95% CI：1.03～1.98，P＝0.049；表3)和因心絞痛再入院的發(fā)生率(校正OR：1.67，95% CI：1.04～2.68，P＝0.032；表3)也較非攜帶者明顯增加。CYP2C19*3攜帶者與非攜帶者之間心血管終點(diǎn)事件差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，數(shù)據(jù)未列入表中)。

表2 代謝候選相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性的分布Table 2 Distribution of single nucleotide polymorphism of candidate genes (n＝436)

圖1 候選基因變異型與氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性的相關(guān)分析Figure 1 Correlation analysis of polymorphism of candidate genes with clopidogrel antiplatelet reactivity

3 討論

目前，氯吡格雷聯(lián)合阿司匹林雙聯(lián)抗血小板治療已成為PCI圍術(shù)期和術(shù)后藥物治療的基本方法[7,8]。既往研究提示不同患者間氯吡格雷的抗血小板反應(yīng)性存在顯著變異[9]。目前認(rèn)為，造成這種變異的原因除臨床環(huán)境因素外，遺傳是決定性內(nèi)在因素，而CYP2C19等位基因變異在其中起主導(dǎo)作用[10,11]。此外，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，老年冠心病患者在接受氯吡格雷治療后仍有較高的血小板聚集率，且存在顯著的個(gè)體差異[5,12?14]。由于老年冠心病患者存在合并用藥、并發(fā)病復(fù)雜和藥物代謝能力降低等多種情況，氯吡格雷治療抗血小板反應(yīng)性個(gè)體間的差異是否對(duì)老年冠心病患者的心血管終點(diǎn)事件產(chǎn)生影響仍未知。

本研究發(fā)現(xiàn)，盡管老年冠心病患者存在諸多混雜因素，CYP2C19*2和CYP2C19 LOF等位基因變異型均與氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性降低密切相關(guān)。這與目前大型臨床試驗(yàn)結(jié)果和本課題組前期研究結(jié)果一致[12?14]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，該人群中CYP2C19*2和CYP2C19 LOF基因型攜帶者PCI術(shù)后發(fā)生心絞痛再次入院和聯(lián)合心血管事件等終點(diǎn)事件的風(fēng)險(xiǎn)均顯著高于非攜帶者，符合既往CYP2C19的基因型變異可增加患者發(fā)生心血管終點(diǎn)事件的風(fēng)險(xiǎn)的研究結(jié)論[15?17]。Liu等[18]和唐曉芳等[19]發(fā)現(xiàn)，PCI術(shù)后至少1個(gè)CYP2C19 LOF等位基因攜帶者發(fā)生再次心絞痛、緊急血運(yùn)重建和聯(lián)合終點(diǎn)事件的風(fēng)險(xiǎn)較非攜帶者更高。在PCI術(shù)后服用氯吡格雷1年內(nèi)發(fā)生心血管終點(diǎn)事件的風(fēng)險(xiǎn)與CYP2C19 LOF等位基因變異仍密切相關(guān)，說(shuō)明藥物基因組學(xué)因素在老年冠心病患者氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性的個(gè)體差異中仍發(fā)揮重要作用。

表3 隨訪1年心血管終點(diǎn)事件發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)分別與CYP2C19*2等位基因攜帶者和CYP2C19 LOF等位基因攜帶者之間的關(guān)系Table 3 The risks of cardiovascular events after 1 year follow-up according to CYP2C19*2 allele carriers and CYP2C19 LOF allele carriers in comparison to non-carriers

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19等位基因變異型是影響老年冠心病患者PCI術(shù)后的氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性和心血管終點(diǎn)事件的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。攜帶該基因變異型的患者可能需要調(diào)整服用氯吡格雷的劑量或者更換其他類型抗血小板藥物。本研究為臨床早期預(yù)測(cè)氯吡格雷血小板反應(yīng)性提供藥物基因組學(xué)依據(jù)，對(duì)預(yù)防老年冠心病患者心血管終點(diǎn)事件的發(fā)生具有重要意義。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Dehmer GJ,Blankenship JC,Cilingiroglu M,et al.SCAI/ACC/AHA Expert Consensus Document:2014 update on percutaneous coronary intervention without on-site surgical backup[J].J Am Coll Cardiol,2014,63(23):2624?2641.

[2]Jeong YH,Tantry US,Kim IS,et al.Effect of CYP2C19*2 and*3 loss-of-function alleles on platelet reactivity and adverse clinical events in East Asian acute myocardial infarction survivors treated with clopidogrel and aspirin[J].Circ Cardiovasc Interv,2011,4(6):585?594.

[3]Mega JL,Close SL,Wiviott SD,et al.Cytochrome p-450 polymorphisms and response to clopidogrel[J].N Engl J Med,2009,360(4):354?362.

[4]Holmes MV,Perel P,Shah T,et al.CYP2C19 genotype,clopidogrel metabolism, platelet function, and cardiovascular events:a systematic review and meta-analysis[J].JAMA,2011,306(24):2704?2714.

[5]Ancrenaz V,Daali Y,Fontana P,et al.Impact of genetic polymorphisms and drug-drug interactions on clopidogrel and prasugrel response variability[J].Curr Drug Metab,2010,11(8):667?677.

[6]Anderson JL,Adams CD,Antman EM,et al.2012 ACCF/AHA focused update incorporated into the ACCF/AHA 2007 Guidelines for the Management of Patients with Unstable Angina/Non-ST-elevation Myocardial Infarction:a report of the American College of Cardiology Foundation/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines[J].Circulation,2013,127(23):E663?E828.

[7]Mehta SR,Yusuf S,Peters RJ,et al.Effects of pretreatment with clopidogrel and aspirin followed by long-term therapy in patients undergoing percutaneous coronary intervention:the PCI-CURE study[J].Lancet,2001,358(9281):527?533.

[8]Siller-Matula J,Schr?r K,Wojta J,et al.Thienopyridines in cardiovascular disease:focus on clopidogrel resistance[J].Thromb Haemost,2007,97(3):385?393.

[9]Angiolillo DJ,Fernandez-Ortiz A,Bernardo E,et al.Variability in individual responsiveness to clopidogrel:clinical implications, management, and future perspectives[J].J Am Coll Cardiol,2007,49(14):1505?1516.

[10]Sibbing D,Schulz S,Braun S,et al.Antiplatelet effects of clopidogrel and bleeding in patients undergoing coronary stent placement[J].J Thromb Haemost,2010,8(2):250?256.

[11]Bergmeijer TO,Janssen PW,Schipper JC,et al.CYP2C19 genotype-guided antiplatelet therapy in ST-segment elevation myocardial infarction patients—rationale and design of the Patient Outcome after Primary PCI(POPular)Genetics study[J].Am Heart J,2014,168(1):16?22.e1.

[12]Tanaka E.In vivoage-related changes in hepatic drug-oxidizing capacity in humans[J].J Clin Pharm Ther,1998,23(4):247?255.

[13]Zhang LN,Lu CY,Yin T.Pharmacogenomics and individualized therapy of clopidogrel：evidence and perspectives[J].Chin J Mult Organ Dis Elderly,2013,12(12):944?948.[張藍(lán)寧,盧才義,尹 彤.氯吡格雷藥物基因組學(xué)及個(gè)體化治療研究進(jìn)展與展望[J].中華老年多器官疾病雜志,2013,12(12):944?948.]

[14]Zhang LN,Zheng XQ,Xu B,et al.Pharmacogenomic analysis of clopidogrel antiplatelet reactivity in Chinese Han elderly patients with acute coronary syndrome[J].Chin J Mult Organ Dis Elderly,2012,11(12):906?911.[張藍(lán)寧,鄭小琴,徐 斌,等.中國(guó)漢族老年人急性冠脈綜合征患者氯吡格雷抗血小板反應(yīng)性的藥物基因組學(xué)分析[J].中華老年多器官疾病雜志,2012,11(12):906?911.]

[15]Collet JP,Hulot JS,Pena A,et al.Cytochrome P450 2C19 polymorphism in young patients treated with clopidogrel after myocardial infarction:a cohort study[J].Lancet,2009,373(9660):309?317.

[16]Hulot JS,Collet JP,Silvain J,et al.Cardiovascular risk in clopidogrel-treated patients according to cytochrome P450 2C19*2 loss-of-function allele or proton pump inhibitor coadministration:a systematic meta-analysis[J].J Am Coll Cardiol,2010,56(2):134?143.

[17]Mao L,Jian C,Changzhi L,et al.Cytochrome CYP2C19 polymorphism and risk of adverse clinical events in clopidogrel-treated patients:a meta-analysis based on 23 035 subjects[J].Arch Cardiovasc Dis,2013,106(10):517?527.

[18]Liu Y,Liu N,Li W,et al.Relationship of CYP2C19*2 and CYP2C19*3 gene polymorphism with clopidogrel response variability and recurrent cardiovascular events in Chinese patients undergoing percutaneous coronary intervention[J].Pharmacology,2013,91(3?4):165?172.

[19]Tang XF,He C,Yuan JQ,et al.Impact of cytochrome P450 2C19 polymorphisms on outcome of cardiovascular events in clopidogrel-treated Chinese patients after percutaneous coronary intervention[J].Chin J Cardiol,2011,39(7):617?620.[唐曉芳,何 晨,袁晉青,等.細(xì)胞色素P450 2C19基因多態(tài)性對(duì)介入術(shù)后服用氯吡格雷冠心病患者臨床預(yù)后的影響[J].中華心血管病雜志,2011,39(7):617?620.]