小檗堿的降糖作用獨(dú)立于AMPK的信號通路

肖元元，徐 淼，殷 峻，沈 麗，魏 麗

（上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，上海市糖尿病臨床醫(yī)學(xué)中心，上海市糖尿病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市糖尿病研究所，上海市代謝病臨床醫(yī)學(xué)中心，上海 200233）

小檗堿又名黃連素，是中醫(yī)治療消渴疾病常用藥物黃連的主要成分。早年我們在篩選有降糖作用的中藥活性成分時(shí)，發(fā)現(xiàn)小檗堿具有良好的體外降糖效應(yīng)[1,2]。隨后的研究證實(shí)，小檗堿能在肝細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞類型中發(fā)揮非胰島素依賴性的降糖作用[3]。我們將小檗堿應(yīng)用于肥胖大鼠及2型糖尿病患者，發(fā)現(xiàn)小檗堿不僅能夠降糖，還有調(diào)節(jié)脂代謝的作用[4?6]。目前一般認(rèn)為，小檗堿的作用機(jī)制為激活單磷酸腺苷激活蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinase，AMPK）[7]。AMPK被認(rèn)為是“代謝總開關(guān)”，在能量平衡的調(diào)節(jié)中起到重要的作用[8]。然而，我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿在通過抑制線粒體的有氧呼吸而刺激糖酵解，以此增加葡萄糖的利用[3]，這一過程中并不必須AMPK的參與。因此，本研究旨在探討小檗堿的降糖作用與AMPK信號通路激活之間的關(guān)系，以進(jìn)一步闡明小檗堿的降糖作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

HepG2細(xì)胞、C2C12細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞所）。鹽酸小檗堿（中國藥品生物制品檢定所），化合物C（Compound C，CC，默克公司）。表達(dá)顯性失活突變型AMPK，即腺病毒負(fù)顯性AMPK（adenovirusdominant negative-AMPK，Ad-DN-AMPK）腺病毒以及對照組，即腺病毒綠色熒光蛋白（Ad-green fluorescent protein，Ad-GFP）腺病毒（中國科學(xué)院上海藥物研究所李佳教授惠贈）[9]。低糖杜爾貝科改良培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）培養(yǎng)液，高糖DMEM培養(yǎng)液，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），胰蛋白酶，青鏈霉素雙抗（均Gibco公司），抗p-AMPK抗體，抗t-AMPK抗體，抗p-乙酰輔酶A羧化酶（acetyl coA carboxylase，ACC）抗體，抗t-ACC抗體，抗β-actin抗體（CST公司），辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗（Promega公司）。乳酸測定試劑盒（購自上海聚創(chuàng)生物科技有限公司），葡萄糖檢測試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 C2C12細(xì)胞培養(yǎng)與處理 小鼠骨骼肌成纖維細(xì)胞C2C12，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70%～80%后，將細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于12孔板中，分別設(shè)置對照組和CC處理組。待細(xì)胞貼壁后，對兩組細(xì)胞以含0.25%BSA的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，選用10μmol/L的CC預(yù)處理細(xì)胞30min后，給予不同濃度小檗堿處理24h。

1.2.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)與病毒轉(zhuǎn)染 人肝癌HepG2細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70%～80%后，將細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于12孔板中，分別設(shè)置空白對照組（空載體腺病毒Ad-GFP轉(zhuǎn)染組）和實(shí)驗(yàn)組（重組腺病毒Ad-DN-AMPK轉(zhuǎn)染組）。待細(xì)胞貼壁24h后，對兩組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔更換500μl含病毒無血清培養(yǎng)基（感染復(fù)數(shù)＝20），輕柔混勻并置于37℃ 5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育，6h后更換成完全培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)染后第24小時(shí)和48小時(shí)于熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)情況[9]。

1.2.3 葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn) HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，鋪板后，待細(xì)胞長至80%融合，給予腺病毒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后24h將培養(yǎng)液換為含有0.25%BSA的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)孵育，12h后將培養(yǎng)液換為含0.25%BSA的不同濃度小檗堿的培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24h。C2C12細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后，用含0.25%BSA的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，以10μmol/L的CC預(yù)處理細(xì)胞30min后，再給予不同濃度小檗堿處理24h。各組細(xì)胞用葡萄糖氧化酶法，檢測細(xì)胞上清中葡萄糖含量，同時(shí)用不鋪細(xì)胞的空白孔內(nèi)葡萄糖含量與之相減，得出各孔的葡萄糖消耗量[2]。

1.2.4 乳酸生成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種于96孔板中，如上所述對細(xì)胞給予處理后，用不同濃度的小檗堿孵育細(xì)胞24h，按照乳酸檢測試劑盒說明，測定各組細(xì)胞上清中乳酸生成水平。

1.2.5 Western印跡法檢測 接種于12孔板中的細(xì)胞經(jīng)各組處理后，以預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗2次，加入含有苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，用干凈的細(xì)胞刮刀將細(xì)胞刮下并轉(zhuǎn)移至離心管中。4℃12 000r/min離心15min，吸取上清，于100℃下變性10min后經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳。低溫下轉(zhuǎn)膜2h，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，TBST洗膜5min，3次。4℃孵育一抗過夜，TBST洗膜5min，3次；二抗于室溫孵育1h，TBST洗膜，常規(guī)顯影，拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)處理軟件分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)以n表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小檗堿對細(xì)胞的降糖作用

為了篩選小檗堿對細(xì)胞具有最佳降糖效果時(shí)的濃度，本研究檢測了用3種不同濃度藥物處理24h后，細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖消耗量和乳酸生成水平。結(jié)果顯示，小檗堿5，10和20μmol/L處理HepG2細(xì)胞，使細(xì)胞葡萄糖的消耗量較對照組分別升高12.34%、31.5%和34.9%（P＜0.001；圖1A），在C2C12細(xì)胞內(nèi)，小檗堿使得細(xì)胞的葡萄糖消耗量較對照組分別升高了46.7%、63.3%和1.05倍（P＜0.01；圖1B）。而5，10和20μmol/L的小檗堿使HepG2細(xì)胞內(nèi)的乳酸生成較對照組分別升高了59.95%、69.79%和75.90%（P＜0.001；圖1C），使C2C12細(xì)胞內(nèi)的乳酸生成較對照組分別升高了40.67%、49.40%和40.93%（P＜0.001；圖1D），由此可見小檗堿可以明顯促進(jìn)HepG2細(xì)胞以及C2C12細(xì)胞的葡萄糖消耗，且這種作用主要是通過增加細(xì)胞的無氧呼吸促進(jìn)乳酸合成而發(fā)揮的。

圖1 小檗堿對細(xì)胞葡萄糖消耗與乳酸生成的劑量相關(guān)關(guān)系Figure 1 Dose-dependent effects of berberine on glucose consumption and lactate production in HepG2 and C2C12 cells

2.2 AMPK活性抑制時(shí)小檗堿對C2C12細(xì)胞的降糖作用

AMPK化學(xué)抑制劑CC可阻斷AMPK通路，抑制AMPK下游信號的傳導(dǎo)。因此我們利用CC抑制AMPK活性，在此基礎(chǔ)上觀察小檗堿是否仍存在明顯的降糖作用。選用10μmol/L的CC預(yù)處理細(xì)胞30min后，再加入5，10μmol/L的小檗堿處理24h來阻斷AMPK通路。在此基礎(chǔ)上對細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖消耗和乳酸生成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在C2C12細(xì)胞中，小檗堿處理組的葡萄糖消耗較對照組分別升高了52%和66%（P＜0.01），乳酸生成較對照組分別升高了36%和45%倍（P＜0.01）。但同時(shí)給予CC組的細(xì)胞在進(jìn)行小檗堿處理后，葡萄糖消耗和乳酸生成水平也較單獨(dú)給予CC組分別升高了52%、68.6%和46%、56%（P＜0.01；圖2A、B）。由此可見，當(dāng)AMPK活性受到抑制時(shí)，小檗堿仍存在促進(jìn)C2C12細(xì)胞葡萄糖代謝以及無氧呼吸的作用。

圖2 AMPK活性抑制下小檗堿對C2C12細(xì)胞葡萄糖攝取和乳酸生成的影響Figure 2 Effect of berberine on glucose consumption and lactate production under the condition of AMPK inhibited

2.3 無活性AMPK過表達(dá)條件下小檗堿對HepG2細(xì)胞的降糖作用

為了進(jìn)一步明確AMPK的激活對小檗堿降糖作用的影響，我們同時(shí)利用過表達(dá)顯性失活后突變型AMPK，即負(fù)顯性AMPK（dominant negative AMPK，DN-AMPK）的腺病毒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，使得細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)無活性AMPKα亞基與內(nèi)源性正常AMPKα亞基競爭結(jié)合β和γ亞單位，使細(xì)胞內(nèi)的AMPK總體表現(xiàn)為無活性狀態(tài)，從而起到干擾AMPK的作用。重組Ad-DN-AMPKα感染HepG2細(xì)胞24h后，通過與轉(zhuǎn)染Ad-GFP對照組比較可見，AMPK表達(dá)顯著升高，而且在小檗堿處理24h后，陰性對照組中的AMPK的Thr172位磷酸化增加，并且其下游蛋白ACC的S79位磷酸化也顯著增加，但是當(dāng)轉(zhuǎn)染Ad-DN-AMPK后，DN-AMPK高表達(dá)，小檗堿處理后AMPK對ACC的磷酸化受到抑制，這表明DN-AMPK影響了內(nèi)源性AMPK自身的激酶活性（圖3A）。在此基礎(chǔ)上，對細(xì)胞進(jìn)行葡萄糖消耗和乳酸生成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與對照組相比，5和10μmol/L的小檗堿處理使HepG2細(xì)胞中葡萄糖的消耗和乳酸生成分別升高了13.5%、34.6%（P＜0.01）和61.7%%（P＜0.05）、70.9%（P＜0.01），而在轉(zhuǎn)染了Ad-DN-AMPK的情況下，小檗堿仍舊使得HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗和乳酸生成分別升高了13.2%、29.4%%（P＜0.01）和63%（P＜0.05）、70%（P＜0.01）（圖3B、C），由此說明細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)無活性AMPKα，小檗堿仍存在促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗以及無氧呼吸的作用。

圖3 AMPKɑ活性干擾時(shí)小檗堿對HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗和乳酸生成的影響Figure 3 Effect of berberine on glucose consumption and lactate production in dominant negative AMPK transfected HepG2 cells

3 討 論

小檗堿是中藥黃連的主要成分，具有廣泛的藥理作用，臨床上可以用于多種疾病的治療，近年來的研究發(fā)現(xiàn)小檗堿對糖尿病的治療也具有良好的效果。我們既往的研究證實(shí)，無論在體外培養(yǎng)的細(xì)胞系還是在動物或人體內(nèi)，小檗堿都具有顯著的降糖作用，且藥物的作用模式和效果與二甲雙胍相似，它們均可以增加肝臟、脂肪和肌肉等組織對葡萄糖的消耗及攝取，同時(shí)改善上述組織的胰島素敏感性[3,4]。

以往的研究認(rèn)為，小檗堿的降糖作用與二甲雙胍一樣，都是通過激活A(yù)MPK而發(fā)揮的。AMPK是一種保守的絲/蘇氨酸激酶，被視為平衡全身及細(xì)胞能量狀態(tài)的調(diào)試器，它由一個(gè)催化基團(tuán)α亞基和兩個(gè)調(diào)節(jié)基團(tuán)β、γ亞基組成。AMPK激活藥物可刺激AMPKα亞基活化環(huán)Thr172位點(diǎn)的磷酸化，使得AMPK活性增強(qiáng)，進(jìn)而影響其下游代謝相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，最終抑制糖、脂、蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞生長，促進(jìn)葡萄糖的攝取和脂肪酸的氧化[10]。但近些年的研究發(fā)現(xiàn)，利用基因消融的方法在小鼠肝以及原代肝細(xì)胞中抑制AMPKα及其上游激酶LKB1后，二甲雙胍仍舊能夠引起肝葡萄糖輸出的減少，提示AMPKα和LKB1并非二甲雙胍降糖作用的主要靶點(diǎn)[11]。該結(jié)果使得傳統(tǒng)觀念中AMPK在二甲雙胍作用中的關(guān)鍵地位被撼動。

與二甲雙胍的傳統(tǒng)機(jī)制相似，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)小檗堿也可以增強(qiáng)AMPK的活性，并通過磷脂酰肌醇?3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）非依賴的途徑促進(jìn)L6骨骼肌細(xì)胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporter type 4，GLUT4）的轉(zhuǎn)運(yùn)和葡萄糖攝取[12,13]。同樣在我們過去的研究中也發(fā)現(xiàn)，小檗堿確實(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)AMPK的磷酸化，該作用可能與其抑制線粒體功能進(jìn)而增加細(xì)胞內(nèi)AMP/ATP比值相關(guān)[3]。但小檗堿的降糖作用是否依賴于AMPK，既往尚無相關(guān)研究。

本研究結(jié)果顯示，給予HepG2細(xì)胞和C2C12細(xì)胞小檗堿處理24h，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的消耗和乳酸生成水平顯著升高，并且AMPK及其下游信號分子ACC的磷酸化水平也較對照組有所增加，這與以往的研究結(jié)果相一致，證實(shí)小檗堿確實(shí)可以激活細(xì)胞內(nèi)的AMPK信號通路，但此結(jié)果是否說明小檗堿對細(xì)胞糖代謝的調(diào)節(jié)作用就是通過AMPK信號通路所發(fā)揮呢？為明確其中詳細(xì)的作用機(jī)制，我們首先應(yīng)用AMPK化學(xué)抑制劑CC作用細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上對細(xì)胞給予小檗堿處理，結(jié)果表明，小檗堿在AMPK被抑制的條件下，依然能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞的葡萄糖消耗和乳酸生成水平。

此外，我們還利用Ad-DN-AMPK的腺病毒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。這種AMPK主要是通過將AMPKα1的159位天冬氨酸突變?yōu)楸彼幔蛊鋯适TP的結(jié)合能力[14]，同時(shí)將AMPKα2的45位賴氨酸突變?yōu)榫彼幔瑥亩笰MPKα2亞基激酶活性喪失[15]，兩者的突變使得細(xì)胞內(nèi)的AMPKα處于失活狀態(tài)。過表達(dá)無活性的AMPKα亞基與內(nèi)源性正常的α亞基競爭β和γ亞單位，從而使細(xì)胞內(nèi)的AMPK表現(xiàn)為無活性狀態(tài)，起到干擾AMPK的作用。在此基礎(chǔ)上我們發(fā)現(xiàn)，干擾了AMPK的活性后，小檗堿仍存在促進(jìn)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗與乳酸生成的作用，并且發(fā)現(xiàn)Ad-DN-AMPK組細(xì)胞的這一作用與Ad-GFP對照組無明顯差異。這一結(jié)果進(jìn)一步提示，小檗堿促進(jìn)葡萄糖消耗與無氧糖酵解的作用可能是AMPK非依賴性的。

綜上所述，本研究揭示，小檗堿的降糖作用并不依賴于AMPK的激活。結(jié)合我們以往的工作，小檗堿作用的核心機(jī)制可能為抑制線粒體的有氧呼吸，導(dǎo)致糖酵解的上調(diào)[3]，AMPK是線粒體功能抑制的結(jié)果，并非小檗堿的降糖作用所必需。

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